李 川，喬江方，朱衛(wèi)紅，代書桃，黃 璐，張美微，劉京寶

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002)

溫度是影響作物生長發(fā)育及產(chǎn)量品質(zhì)的主要因素之一。據(jù)報道，21世紀全球平均地表氣溫將比20世紀升高1.4～5.8 ℃。近年來我國短期異常高溫頻發(fā)[1]。玉米在抽雄吐絲期對溫度尤為敏感[2],玉米授粉的適宜日平均溫度為25～28 ℃。黃淮海平原是我國夏玉米核心產(chǎn)區(qū)，其年高溫期(7月下旬-8月上旬)恰逢黃淮海平原夏玉米抽雄散粉及吐絲受精期。花粒期高溫脅迫降低玉米花粉活力、影響花絲生長[3]、阻礙授粉受精過程、影響籽粒庫容的形成，從而導致籽粒敗育率增加[4]，造成有效籽粒減少及籽粒容重降低[5]，最終對該地區(qū)夏玉米產(chǎn)量及品質(zhì)造成嚴重損失?；Ｆ诟邷孛{迫對不同基因型玉米危害程度不同[5]。因此，很有必要深入開展玉米花粒期高溫脅迫對不同基因型玉米分子機理影響的研究，從而挖掘玉米耐高溫脅迫的關(guān)鍵基因及其代謝途徑，為利用生物技術(shù)手段提高玉米耐高溫脅迫提供理論依據(jù)。

國內(nèi)外學者多從產(chǎn)量指標及生理生化特征對玉米花粒期高溫脅迫開展研究。趙龍飛等[6]研究發(fā)現(xiàn)，花粒期高溫脅迫導致玉米花粉敗育及雌雄間隔期延長，穗粒數(shù)及行粒數(shù)減少，穗粗變小，穗長變短，禿尖增加，最終造成產(chǎn)量減少。花粒期高溫脅迫降低了玉米花粉活力、葉綠素含量、葉片光合速率[7]、葉片氣孔導度、丙二醛(MAD)含量、籽粒ATPase活性以及根系活力[8]，提高超氧化物歧化酶(SOD)[9]、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)3種氧化物酶的活性以及葉片細胞間CO2濃度[10-11]。品質(zhì)方面，花粒期高溫脅迫增加玉米籽粒粗蛋白、粗脂肪和賴氨酸含量[12]。花粒期高溫脅迫降低了玉米腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)和可溶性淀粉合成酶(SSS)活性[13]，從而降低了籽粒內(nèi)淀粉含量[14]。

目前玉米增溫處理多在人工氣候室或大田模擬條件下進行，研究結(jié)果不盡一致。灌漿期白天溫度超過35 ℃后玉米單位面積產(chǎn)量平均減產(chǎn)42%。日平均溫度在10～25 ℃，玉米灌漿速率隨著溫度的升高而升高；25～35 ℃玉米灌漿速率開始降低，溫度每升高1 ℃，籽粒產(chǎn)量降低3%～4%。玉米灌漿速率在40～45 ℃時顯著降低。李德等[15]根據(jù)決定熱害程度大小的極端最高氣溫、日最高氣溫≥35 ℃的天數(shù)、日最高氣溫≥35 ℃的積害量、高溫期間平均最小相對濕度4個花粒期高溫致災(zāi)因子構(gòu)建了玉米高溫熱害綜合氣候指數(shù)。綜合氣候指數(shù)與高溫熱害減產(chǎn)率呈顯著正相關(guān)，比僅將日平均氣溫≥30 ℃或日最高氣溫≥35℃持續(xù)3 d及以上作為評估和預(yù)警作物高溫熱害指標更加準確?；Ｆ诟邷孛{迫對不同基因型玉米影響不同，高溫脅迫下耐熱基因型玉米浚單20比熱敏感基因型玉米駐玉309可以保持更強的根系活力、光合作用能力及更高的抗氧化酶、ATP酶活性。于康珂等[16]對耐熱基因型玉米鄭單958和熱敏感基因型玉米先玉335花期模擬大田條件增溫4.03 ℃后發(fā)現(xiàn)雌雄穗中抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)、MAD、可溶性糖、脯氨酸、可溶解性蛋白均有較大的差異。于康珂等[17]通過16個相關(guān)性狀指標綜合評價了黃淮海地區(qū)主栽的30個玉米品種的花粒期耐熱性。自交系所屬類群與耐高溫性相關(guān)，黃改系及農(nóng)家品種耐高溫性較強，旅大紅骨系統(tǒng)的耐高溫性較差。花粒期高溫脅迫對不同基因型玉米生理生化影響都有所不同，但是對花粒期耐熱性較強的鄭單958的母本鄭58及父本昌7-2耐熱性分子機理的研究尚未明確。鑒于此，對我國玉米骨干自交系昌7-2、鄭58花粒期高溫脅迫后收集花粉進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，對差異表達基因進行分析注釋，找到響應(yīng)高溫脅迫的重要基因及其調(diào)控途徑，為用分子生物學技術(shù)手段提高玉米抗熱性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗選用國內(nèi)玉米骨干自交系鄭58、昌7-2作為供試材料，于2017年6月10日播種于河南省農(nóng)業(yè)科學院原陽縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范基地，標準化大田管理。試驗田前茬作物為冬小麥，土壤為潮土，地勢平坦，排灌方便，地力均勻一致。

1.2 試驗設(shè)計

主要試驗因素為溫度，高溫處理用長×寬×高為20 m×15 m×4 m的自制生長箱框架固定于田間，周圍用透光率為95%的樹脂薄膜覆蓋，頂部密封80%，均勻留出20%的空隙便于氣體交換。從第9片葉片展開時進行增溫處理，直至抽雄吐絲期結(jié)束。期間每天的8：30-17：30通過覆蓋薄膜進行增溫，用溫濕計記錄群體穗位處氣溫及相對濕度。以棚外自然條件下生長的玉米植株作為對照。高溫處理結(jié)束后拆除生長箱，使玉米植株在自然條件下生長，試驗重復(fù)3次。高溫處理期間生長箱內(nèi)氣溫平均高于外界田間4.5 ℃，光照強度、相對濕度等生長條件與生長箱外基本一致。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 花粉活性檢測 玉米植株抽雄開始散粉后分別收集3株玉米的花粉，立即用于花粉活性鑒定。將昌7-2、鄭58的高溫處理材料及其對照樣本分別命名為： HT昌7-2、CK昌7-2、HT鄭58、CK鄭58。玉米花粉活性采用AmphaTMZ30花粉活性分析儀(Amphays,瑞士)進行測定。AmphaTMZ30花粉活性分析儀是基于阻抗分析的流式細胞儀，無需染色，實時不間斷檢測單個細胞在電場中的阻抗，操作簡便，以點圖形顯示花粉活性的百分比率。

1.3.2 花藥轉(zhuǎn)錄組測序 玉米植株散粉后開始收集花粉樣本，每個樣本由5株玉米花粉混合組成，不同處理基因型材料重復(fù)取花粉3次，立即置于液氮中，然后于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于提取花粉RNA進行全轉(zhuǎn)錄組測序分析。全轉(zhuǎn)錄測序由上海美吉生物公司完成。將昌7-2、鄭58的高溫處理材料及其對照樣本分別命名為：HT鄭58-1、HT鄭58-2、HT鄭58-3；CK鄭58-1、CK鄭58-2、CK鄭58-3；HT昌7-2-1、HT昌7-2-2、HT昌7-2-3；CK昌7-2-1、CK昌7-2-2、CK昌7-2-3。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米自交系花粒期高溫脅迫后花粉活性分析

AmphaTMZ30花粉活性分析儀檢測結(jié)果顯示，正常生長條件下CK昌7-2、CK鄭58的花粉活性分別為42.89%,64.83%。高溫脅迫后HT昌7-2、HT鄭58的花粉活性分別為24.37%，35.57%。由此可見，高溫脅迫處理大大降低了玉米骨干自交系昌7-2和鄭58的花粉活力。

2.2 玉米自交系花粒期高溫脅迫后測序產(chǎn)量統(tǒng)計及基因組比對

HT昌7-2-1轉(zhuǎn)錄組經(jīng)過上機測序后獲得了64 923 124條初始化序列，經(jīng)過質(zhì)量剪切統(tǒng)計共獲得63 117 492條清除序列(表1)。利用Hisat2序列比對軟件，參照B73基因組分析后有89.60%的mapping序列，得到56 554 484條序列；CK昌7-2-1獲得了65 163 254條初始化序列，經(jīng)過質(zhì)量剪切統(tǒng)計共獲得63 190 882條清除序列。利用Hisat2序列比對軟件，參照B73基因組分析后有91.83%的mapping序列，得到58 029 234條序列；HT鄭58-1獲得了58 732 018條初始化序列，經(jīng)過質(zhì)量剪切統(tǒng)計共獲得56 993 330條清除序列。利用Hisat2序列比對軟件，參照b73基因組分析后有91.71%的mapping序列，得到52 267 437條序列；CK鄭58-1獲得了65 897 202條初始化序列，經(jīng)過質(zhì)量剪切統(tǒng)計共獲得64 019 786條清除序列利用Hisat2序列比對軟件，參照玉米自交系B73基因組分析后有91.88%的mapping序列，得到58 823 393條序列。

2.3 玉米自交系花粒期高溫脅迫造成的轉(zhuǎn)錄組差異

為了探索花粒高溫脅迫對基因表達的影響，分別用昌7-2、鄭58高溫脅迫和正常生長條件下的花粉進行全轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)過序列飽和度、覆蓋度和冗余度等分析后，與公布的參照基因組比對后共得到47 560個基因，上調(diào)表達基因多于下調(diào)表達基因，見圖1。尤其是自交系鄭58轉(zhuǎn)錄組中下調(diào)基因遠遠少于上調(diào)基因。用fpkm(每1 000 000條序列中每個基因以1 000個堿基為單位)比對上的reads個數(shù)來衡量比對基因的表達水平。以P<0.05，|log2FC|≥為篩選標準，在CK昌7-2和HT昌7-2的花粉轉(zhuǎn)錄組中共檢測到3 386個特異的差異顯著表達基因。在CK鄭58和HT鄭58的花粉轉(zhuǎn)錄組中共檢測到4 697個特異的差異顯著表達基因。其中790個差異顯著表達基因均在昌7-2和鄭58不同玉米自交系花粉轉(zhuǎn)錄組中表達。即高溫脅迫后在昌7-2花粉轉(zhuǎn)錄組中共檢測到4 176個顯著差異表達基因，鄭58花粉轉(zhuǎn)錄組中共檢測到5 487個顯著差異表達基因。

表1 玉米自交系12個花藥樣本轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計Tab.1 The statistical sequencing results of the 12 maize anther samples

圖1 正常生長條件及高溫脅迫下昌7-2、鄭58花粉轉(zhuǎn)錄組中差異表達基因熱點Fig.1 The scatter-plot of different expression genes regulated by heat stress in Chang 7-2 and Zheng 58

圖2 玉米自交系昌7-2花粒期高溫脅迫差異表達基因聚類Fig.2 The gene Ontology of different expression genes in Chang 7-2

2.4 花粒期高溫脅迫相關(guān)差異表達基因的分類

按照基因所參與的生物反應(yīng)、細胞組分、分子功能三大類具體功能將檢測的表達差異基因進行分類，圖2為昌7-2花粒期高溫脅迫條件下差異表達基因聚類圖。圖3為鄭58花粒期高溫脅迫條件下差異表達基因聚類圖。在所檢測到的差異表達基因中上調(diào)表達基因的比下調(diào)表達的基因數(shù)目多，主要分布在細胞間相互作用、發(fā)育過程、新陳代謝過程、生物調(diào)控過程、應(yīng)激反應(yīng)、單一組織代謝、細胞組分、結(jié)合作用、催化作用等生命活動中。

在幾千個差異表達基因中尤其值得注意的是在昌7-2轉(zhuǎn)錄組中監(jiān)測到了256個相似的Hsps熱激蛋白和Hsfs熱激轉(zhuǎn)錄因子的表達量在高溫脅迫處理前后發(fā)生了變化。在鄭58轉(zhuǎn)錄組中監(jiān)測到了75個相似的Hsps熱激蛋白和Hsfs熱激轉(zhuǎn)錄因子的表達量在高溫脅迫處理前后發(fā)生了變化。其中包括Hsp41、Hsp20、HspA5、Hsp90B、Hsp16、Hsp22、Hsp70、Hsp72、Hsp23、HspA5、HspD、HspA02、Hsp7R、Hsp7C、HspE1、HspR2等熱激蛋白?；騿幼有蛄蟹治鲋幸舶l(fā)現(xiàn)有26個熱激蛋白基因以及Hsps啟動子序列。熱激蛋白在玉米花粒期響應(yīng)高溫脅迫中起著重要作用。在鄭58、昌7-2自交系中發(fā)現(xiàn)了32個表達生長素IAA相似基因表達量發(fā)生顯著變化。而且在鄭58、昌7-2自交系材料中均發(fā)現(xiàn)12個相似的表達磷脂?；?4,5-二磷酸(PIP2)的基因表達量發(fā)生了顯著性變化。

圖3 玉米自交系鄭58花粒期高溫脅迫差異表達基因聚類Fig.3 The gene Ontology of different expression genes in Zheng 58

昌7-2和鄭58在花粒期高溫脅迫條件下差異表達基因GO富集柱狀圖更加詳細地展示了差異表達基因在不同代謝途經(jīng)中的富集情況(圖4-5)。昌7-2轉(zhuǎn)錄組中測到了11個顯著富集代謝通路，鄭58轉(zhuǎn)錄組中監(jiān)測到了27個顯著富集代謝通路。二者共有4個顯著富集代謝通路，分別為芪類化合物、二芳基庚烷和姜醇生物合成；α-亞麻酸代謝；泛醌和其他萜類化合物醌類的生物合成；丙酸代謝途經(jīng)。昌7-2特有的顯著富集代謝通路:色氨酸代謝途經(jīng)；黃酮類化合物生物合成；類苯基丙烷生物合成；丁酸甲酯代謝途徑；氨基糖和核苷酸糖代謝途徑；酮體物的合成和降解；硫胺素代謝途經(jīng)。鄭58特有的顯著富集代謝通路：過氧化物酶體；核糖體；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解；苯丙氨酸代謝；酪氨酸代謝；C5支鏈二元酸的代謝；丙酮酸代謝；芳香族化合物的降解；2-氧代羧酸代謝；脂肪酸降解；維生素A代謝；谷胱甘肽代謝；檸檬烯和蒎烯降解； 細胞色素P450對異種生物的代謝作用；細胞色素P450藥物代謝；氯烷烴和氯烯烴降解；萘降解；氧化物酶體增殖物激活受體信號通路；甲狀腺激素的合成；雌激素信號通路；抗原加工轉(zhuǎn)運；NOD受體信號通路。

1.雙組分元件系統(tǒng)；2.cAMP信號路徑；3.VEGF信號路徑；4.TGF-β信號路徑；5.色氨酸代謝途經(jīng)；6.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途經(jīng)；7.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解；8.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成；9.苯基丙氨酸代謝途經(jīng)；10.酪氨酸代謝途經(jīng)；11.精氨酸和脯氨酸代謝途經(jīng)；12.賴氨酸生物合成；13.黃酮類化合物生物合成；14.芪類化合物、二芳基庚烷和姜醇生物合成；15.類苯基丙烷生物合成；16.苯并惡嗪烷生物合成；17.異喹啉生物堿生物合成；18.胺菌素生物合成；19.丁酸甲酯代謝途徑；20.氨基糖和核苷酸糖代謝途徑；21.淀粉和蔗糖代謝途經(jīng)；22.乙醛酸鹽和二元羧酸鹽代謝途經(jīng)；23.氮代謝；24.氧化磷酸化；25.硫代謝；26.芳香化合物降解；27.氨基酸生物合成；28.酮體物的合成和降解；29.α-亞麻酸代謝途經(jīng)；30.脂肪酸的降解；31.角質(zhì)素、木質(zhì)素和蠟質(zhì)素的生物合成；32.亞麻酸代謝途經(jīng)；33.甘油酯類代謝途經(jīng)；34.泛醌和其他萜類化合物的生物合成；35.硫胺素代謝途經(jīng)；36.泛酸酯類和CoA的生物合成；37.葉酸碳庫；38.丙氨酸代謝途經(jīng)；39.?；撬岷蛠喤；撬岽x途經(jīng)；40.氰基氨基酸代謝途經(jīng)；41.類胡蘿卜素生物合成；42.油菜素類固醇生物合成；43.雙萜生物合成；44.類帖物質(zhì)生物合成；45.藥物代謝-細胞色素代謝P450；46.萘降解；47.軸突導向；48.平衡電感元件分泌；49.甲狀腺素合成；50.植物生物鐘；51.加壓素借導的水分重吸收；52.醛甾酮借導的鈉元素重吸收；53.近端小管重碳酸鹽再利用；54.胞間DNA識別路徑；55.小體激活反應(yīng)；56.長期增強作用；57.氨基丁酸突觸；58.谷氨酸突觸。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001；圖5同。

1.Tow-component system; 2.cAMP signaling pathway; 3.VEGF signaling pathway; 4.TGF-beta signaling pathway; 5.Trytophan metabolism; 6.Glycine, serine and threonine metabolism; 7.Valine, leucine and isoleucine degradation; 8.Valine, leucine and isoleucine biosynthesis; 9.Phenylalanine metabolism; 10.Tyrosine metabolism; 11.Arginine and proline metabolism; 12.Lysine biosynthesis; 13.Flavonoid biosynthesis; 14.Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis; 15.Phenylpropanoid biosynthesis; 16.Benzoxazinoid biosynthesis; 17.Isoquinoline alkaloid biosynthesis; 18.Monobactam biosybthesis; 19.Butanoate metabolism; 20.Amino sugar and nucleotide sugar metabolism; 21.Starch and sucrose metabolism; 22.Glyoxylate and dicarboxylate metabolism; 23.Nitrogen metabolism; 24.Oxidative phosphorylation; 25.Sulfur metabolism; 26.Degradation of aromatic compounds; 27.Biosynthesis of amino acids; 28.Synthesis and degradation of ketone bodies; 29.Alpla-linolenic acid metabolism; 30.Fatty acid degradation; 31.Cutin, suberine and wax biosynthesis; 32.Linoleic acid metabolism; 33.Glycerolipid metabolism; 34.Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis; 35.Thiamine metabolism; 36.Pantothenate and CoA biosynthesis; 37.One carbon pool by folate; 38.Beta-alanine metabolism; 39.Taurine and hypotaurine metabolism; 40.Cyanoamino acid metabolism; 41.Carotenoid biosynthesis; 42.Brassinosteroid biosynthesis; 43.Diterpenoid biosynthesis; 44.Terpenoid backbone biosynthesis; 45.Drug metabolism-cytochrome P450; 46.Naphthalene degradation; 47.Axon guidance; 48.Bile secretion; 49.Thyroid hormone synthesis; 50.Circadian rhythm-plant; 51.Vasopressin-regulated water reabsorption; 52.Aldosterone-regulated sodium reabsorption; 53.Proximal tubule bicarbonate reclamation; 54.Cytosolic DAN-sensing pathway; 55.Platelet activation; 56.Long-term potentiation; 57.Gabaergic synapse; 58.Glutamatergic synapse.*.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001; The same as Fig.5.

圖4玉米自交系昌7-2花粒期高溫脅迫下差異表達基因GO富集
Fig.4TheDEGenrichment/GOanalysisinChang7-2withandwithouthightemperaturetreatment

1.過氧化物酶體；2.ABC轉(zhuǎn)運體；3.細菌分泌系統(tǒng)；4.PI3K-Akt信號通路；5.mTOR信號通路；6.MAPK信號通路；7.核糖體；8.真核生物核糖體合成；9.氨酰-tRNA合成；10.RNA轉(zhuǎn)運；11.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成；12.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解；13.苯丙氨酸代謝；14.酪氨酸代謝；15.組氨酸代謝；16.色氨酸代謝；17.芪類、二乙烯類和姜辣素生物合成；18.類苯基丙烷生物合成；19.黃酮類生物合成；20.C5支鏈二元酸的代謝；21.丙酮酸代謝；22.丙酸代謝；23.光合作用；24.光合生物碳固定；25.原核生物碳固定途徑；26.芳香族化合物的降解；27.2-氧代羧酸代謝；28.脂肪酸代謝；29.碳代謝；30.脂肪酸降解；31.亞麻酸代謝；32.不飽和脂肪酸的生物合成；33.維生素A代謝；34.泛素和其他萜類化合物醌類的生物合成；35.泛酸鹽和CoA生物合成；36.卟啉和葉綠素代謝；37.維生素b1代謝；38.谷胱甘肽代謝；39.β-氨基丙酸代謝；40.酪蛋白氨基酸代謝；41.檸檬烯和蒎烯降解；42.單萜生物合成；43.細胞色素P450對異種生物的代謝作用；44.細胞色素P450藥物代謝；45.氯烷烴和氯烯烴降解；46.萘降解；47.苯乙烯降解；48.PPAR信號通路；49.甲狀腺激素的合成；50.雌激素信號通路；51.脂肪細胞因子信號通路；52.植物-病原相互作用；53.抗原加工轉(zhuǎn)運；54.NOD樣受體信號通路；55.類膽堿突觸；56.羥色胺突觸；57.谷氨酸突觸；58.突觸囊泡循環(huán)。

1.Peroxisome; 2.ABC transporters; 3.Bacterial secretion system; 4.PI3K-Akt signaling pathway; 5.mTOR signaling pathway; 6.MAPK signaling pathway; 7.Ribosome; 8.Ribosome biogenesis in eukaryotes; 9.Aminoacyl-tRNA biosynthesis; 10.RNA transport; 11.Valine, Leucine and isoleucine biosynthesis; 12.Valine, Leucine and isoleucine degradation; 13.Phenylalanine metabolism; 14.Tyrosine metabolism; 15.Histidine metabolism; 16.Tryptophan metabolism; 17.Stilbenoid, diarytheptanoid and gingerol biosynthesis; 18.Phenylpropanoid biosynthesis; 19.Flavonoid biosynthesis; 20.C5-Branched dibasic acid metabolism; 21.Pyruvate metabolism; 22.Propanoate metabolism; 23.Photosynthesis; 24.Carbon fixation in photosynthetic organisms; 25.Carbon fixation pathways in prokaryotes; 26.Degradation of aromatic compounds; 27.2-Oxocarboxylic acid metabolism; 28.Fatty acid metabolism; 29.Carbon metabolism; 30.Fatty acid degradation; 31.alpha-Linolenic acid metabolism; 32.Biosynthesis of unsaturated fatty acids; 33.Retionl metabolism; 34.Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis; 35.Pantothenate and CoA biosynthesis; 36.Porphyrin and chlorophyll metabolism; 37.Thiamine metabolism; 38.Glutathione metabolism; 39.beta-Alanine metabolism; 40.Cyanoamino acid metabolism; 41.Limonene and pinene degradation; 42.Monoterpenoid biosynthesis; 43.Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450; 44.Drug metabolism-cytochrome P450; 45.Chloroalkane and chloroalkene degradation; 46.Naphthalene degradation; 47.Styrene degradation; 48.PPAR signaling pathway; 49.Thyroid hormone synthesis; 50.Estrogen signaling pathway; 51.Adipocytokine signaling pathway; 52.Plant-pathogen interaction; 53.Antigen processing and presentation; 54.NOD-like receptor signaling pathway; 55.Cholinergic synapse; 56.Serotonergic synapse; 57.Glutamatergic synapse; 58.Synaptic vesicle cycle.

圖5玉米自交系鄭58花粒期高溫脅迫下差異表達基因GO富集
Fig.5TheDEGenrichment/GOanalysisinZheng58withandwithouthightemperaturetreatment

2.5 與高溫脅迫相關(guān)的代謝通路

KEGG是系統(tǒng)分析基因功能、聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識庫。利用KEGG數(shù)據(jù)庫將差異表達基因按照參與的pathway通路或功能進行分類，并以參照樣本為對照繪制差異表達基因KEGG注釋通路圖。結(jié)果顯示，在鄭58正常生長條件下和高溫處理脅迫下的花粉轉(zhuǎn)錄組中有2 062個差異表達基因富集到399個相關(guān)通路上。在昌7-2正常生長條件和高溫處理條件下的花粉轉(zhuǎn)錄組中有1 943個差異表達基因富集到352個相關(guān)通路上。這些代謝通路參與玉米生長發(fā)育的多個生物代謝途徑,其中包括果糖和甘露糖代謝途徑(圖6)以及光合代謝途徑(圖7)等玉米中重要生物代謝過程。

2.6 與高溫脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子分析

通過花粉轉(zhuǎn)錄組測序后轉(zhuǎn)錄因子分析共獲得55個轉(zhuǎn)錄因子家族，其中有45個轉(zhuǎn)錄因子都包含10個以上差異表達基因，如表2所示。其中26個基因都包含有熱激蛋白Hsps表達基因，分別是：GRMZM2G010871_P03、GRMZM2G132971_P01、GRMZM2G164909_P01、AC216247.3_FGP001、GRMZM2G118485_P01、GRMZM2G165972_P02、GRMZM2G115456_P01、GRMZM2G098696_P01、GRMZM2G384339_P01、GRMZM2G105348_P01、GRMZM2G179802_P02、GRMZM2G059851_P01、AC206165.3_FGP007、GRMZM2G125969_P01、GRMZM2G139535_P01、AC205471.4_FGP003、GRMZM2G086880_P01、GRMZM2G118453_P01、GRMZM2G173090_P01、GRMZM2G118047_P01、GRMZM2G026742_P04、GRMZM2G301485_P01、GRMZM2G005815_P02、GRMZM2G089525_P01、GRMZM2G002131_P01、GRMZM2G088242_P01。推測這些基因在玉米自交系花粉高溫逆境中起著重要作用。從表2可以看出，包含逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達差異基因很多，例如有169個差異基因都包括了MRKY轉(zhuǎn)錄因子。MRKY轉(zhuǎn)錄因子主要參與植物特有的生理過程，包括抗逆和衰老。這些包含MRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因可能在玉米花粉抗高溫過程中扮演重要角色。

. 不同光合代謝途經(jīng)中上調(diào)表達的差異表達基因；. 下調(diào)表達的差異表達基因；. 表達水平差異不顯著的基因；. 不相關(guān)基因。. Up expressing DEGs; . Down expressing DEGs; . The expression is not significant; . Unrelated DGEs.

.上調(diào)表達的差異表達基因；. 下調(diào)表達的差異表達基因。. Up expressing DEGs; . Down expressing DEGs.

3 結(jié)論與討論

花粒期高溫影響花粉外壁加厚及細胞核的有絲分裂過程，從而抑制花粉發(fā)育, 不利于花粉的形成，阻礙開花授粉。本研究檢測了鄭58、昌7-2高溫脅迫和正常生長條件下的花粉活性，結(jié)果顯示，高溫脅迫后的玉米花粉活性比對照花粉活性低，不同基因型材料降低程度不同。鄭58高溫脅迫前后花粉活性均高于昌7-2花粉活性?？梢姴煌蛐陀衩鬃越幌祵Ω邷氐捻憫?yīng)不同，作為鄭單958母本的鄭58花粉活性受高溫影響的程度比父本昌7-2的影響程度要高。文獻報道了水稻花器官相關(guān)性狀與高溫脅迫相關(guān)基因[18]，主要包括花藥發(fā)育過程(Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1)[19]、花藥開裂控制基因(AID1)[20]、光周期調(diào)節(jié)基因(SE5、MADbox家族、RCN1)等[21]。利用花粉轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在昌7-2自交系中存在9類差異表達基因，高溫脅迫下多數(shù)呈上調(diào)表達，表達蛋白有花粉阿拉伯半聚乳糖蛋白BAN102、玉米花粉蛋白C13、花粉蛋白SF3/SF21、玉米花粉激酶參與蛋白、花粉錨蛋白類蛋白、花粉過敏原ph1 p2/p11 蛋白。只有花粉多亮氨酸延伸蛋白呈下調(diào)表達。在鄭58自交系中也發(fā)現(xiàn)了與昌7-2自交系中相同的表達差異基因，花粉錨蛋白類蛋白和玉米花粉激酶參與蛋白兩類基因蛋白除外。推測這兩類差異表達基因在昌7-2自交系響應(yīng)花粒期高溫脅迫時扮演著重要響應(yīng)的高溫脅迫的作用。

表2 玉米高溫花粉轉(zhuǎn)錄組測序表達差異基因轉(zhuǎn)錄因子統(tǒng)計Tab.2 The transcription factors of the different expression genes in Chang 7-2 and Zheng 58

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，2個不同玉米基因型材料存在大量的表達差異基因，其中上調(diào)基因多于下調(diào)基因，這些上調(diào)基因和下調(diào)基因影響了玉米花粒期高溫的抗逆性。經(jīng)過表達差異基因重疊區(qū)域Venn圖分析發(fā)現(xiàn)，昌7-2、鄭58基因組中共有790個相同的差異顯著表達基因。昌7-2中共檢測到了5 487個表達差異顯著基因。鄭58中共檢測到了4 176個表達差異顯著基因。由此可見，自交系昌7-2中檢測到的表達差異顯著基因比自交系鄭58中檢測到的較多。歸屬于生物鐘過程、細胞外基質(zhì)、鳥苷酸交換活性等代謝途徑中表達顯著差異基因上調(diào)表達差異基因明顯多于下調(diào)表達基因。而歸屬于核酸、病毒組分、細胞外組分等生命活動中的表達顯著差異基因中下調(diào)表達差異基因明顯多于上調(diào)表達基因，推測這些基因可能通過負調(diào)控作用增加玉米的抗高溫性。鄭58花粒期高溫脅迫引起表達差異基因聚類GO圖與昌7-2花粒期高溫脅迫引起表達差異基因聚類GO圖有著相似的趨勢，但是上調(diào)表達差異基因數(shù)比昌7-2中多，尤其是在細胞成分組織或生物代謝、生長發(fā)育、免疫系統(tǒng)過程、生物過程正調(diào)控、生物過程負調(diào)控、生殖代謝、生物鐘過程、信號傳導、膜內(nèi)腔、核酸、病毒組分、抗氧化活性、電子載體活性、分子轉(zhuǎn)化活性、蛋白轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子活性以及受體活性等生命活動中上調(diào)表達差異基因明顯多于下調(diào)表達差異基因。從而推測這些基因在鄭58、昌7-2不同基因型中表現(xiàn)的耐受高溫脅迫差異中起著重要的作用。

響應(yīng)植物高溫脅迫網(wǎng)絡(luò)主要包括熱激蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子基因組成的植物高溫脅迫響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、氧化脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子抗逆響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)、激素參與的高溫脅迫應(yīng)答、高溫脅迫下的磷脂信號通路。熱激蛋白(Hsps)參與植物生長發(fā)育過程，包括Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp20、sHsp等家族成員。熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsfs)在植物響應(yīng)高溫脅迫中起著重要作用。水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了19種熱激轉(zhuǎn)錄因子，依據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)可以分為A、B、C 3個家族。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)昌7-2、鄭58自交系中分別有256，75個相似Hsps熱激蛋白和Hsfs熱激轉(zhuǎn)錄因子表達發(fā)生變化，其中包括Hsp41、Hsp20、HspA5、Hsp90B、Hsp16、Hsp22、Hsp70、Hsp72、Hsp23、HspA5、HspD、HspA02、Hsp7R、Hsp7C、HspE1、HspR2等熱激蛋白。在后續(xù)檢測到的基因啟動子序列分析中也發(fā)現(xiàn)有26個熱激蛋白基因以及Hsps啟動子序列。由此推測，熱激蛋白在玉米花粒期高溫脅迫中起著重要作用。

花藥發(fā)育早期對高溫脅迫最為敏感，此時IAA含量顯著降低，最終導致玉米花粉不育[22]。在鄭58、昌7-2自交系中發(fā)現(xiàn)了32個表達IAA相似基因表達發(fā)生顯著變化。玉米代謝途徑圖中顯示了不僅生長素代謝途徑發(fā)生變化，細胞分裂素代謝途徑、赤霉素代謝途徑、水楊酸代謝途徑、乙烯代謝途徑、油菜素內(nèi)酯代謝途徑、茉莉酸代謝途徑、脫落酸代謝途徑中均發(fā)生變化。另一個重要的響應(yīng)玉米花粒期高溫脅迫是磷脂信號通路。當植物處于高溫脅迫時脂膜往往發(fā)生重組現(xiàn)象，改變脂質(zhì)信號，其中包括磷脂酰基醇-4,5-二磷酸(PIP2)和磷脂酸(PA)。在鄭58、昌7-2自交系材料中均發(fā)現(xiàn)12個相似的表達PIP的基因表達水平發(fā)生了顯著性變化。在后續(xù)研究中，可以通過miRNA載體敲除基因家族或者過表達載體轉(zhuǎn)化，從而驗證此類激素基因的具體功能。還可以通過分子育種轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出較耐高溫的玉米自交系，從而用于耐高溫玉米新品種的應(yīng)用。