顏元杰，曹哲明，丁煒東，邴旭文,

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081)

翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)屬鱸形目(Perciformes)，真鱸科(Percichthyidae)，又被稱為鱖魚、桂花魚[1]。翹嘴鱖是中國特有的淡水魚類之一，其性兇猛，屬于食肉性魚類[2]。翹嘴鱖主要分布在中國的江河湖泊中[3]，喜歡棲息在底層，且翹嘴鱖肉質(zhì)鮮嫩，具有豐富的營養(yǎng)[4]。翹嘴鱖肌肉含有豐富的蛋白質(zhì)，可達(dá)到17.56%，且脂肪含量極低，僅有1.50%，是一種優(yōu)質(zhì)的高蛋白魚類[5-6]。隨著翹嘴鱖養(yǎng)殖業(yè)異常迅速的發(fā)展，隨之也帶來各種問題，主要表現(xiàn)在近親交配和種質(zhì)退化上，而且翹嘴鱖的疾病爆發(fā)也日趨嚴(yán)重[7-9]。為了保護(hù)江蘇省野生翹嘴鱖的種質(zhì)資源和選育出優(yōu)良的翹嘴鱖品種，需要對(duì)江蘇省野生鱖魚群體進(jìn)行遺傳多樣性研究。

關(guān)于翹嘴鱖種質(zhì)資源的研究已有報(bào)道。李國慶[10]用RAPD分子標(biāo)記對(duì)廣東和湖南的養(yǎng)殖翹嘴鱖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明2個(gè)翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性都較低，需要對(duì)翹嘴鱖種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)。劉峰等[11]對(duì)3種鱖(翹嘴鱖、大眼鱖Sinipercakneri、斑鱖Sinipercascherzeri)的GH基因進(jìn)行了多態(tài)性檢測分析，結(jié)果表明翹嘴鱖與大眼鱖親緣關(guān)系比較近。方展軍等[12]從60個(gè)隨機(jī)引物中篩選出55個(gè)對(duì)野生翹嘴鱖和養(yǎng)殖翹嘴鱖進(jìn)行群體內(nèi)分析，結(jié)果表明野生翹嘴鱖群體具有較高的遺傳多樣性，野生翹嘴鱖群體和養(yǎng)殖翹嘴鱖群體之間有明顯的遺傳差異，表明人工繁育對(duì)翹嘴鱖的基因造成了顯著的影響。

微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)即簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSRs)，重復(fù)序列由1～6個(gè)核苷酸組成，并相互串聯(lián)組成SSR核苷酸序列[13-15]。SSR序列包括兩部分，分別為核心序列和側(cè)翼序列，核心序列有高度的突變型，而側(cè)翼序列相對(duì)保守，因此可根據(jù)其保守性設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物，并利用PCR擴(kuò)增來檢測微衛(wèi)星多態(tài)性[16]。微衛(wèi)星標(biāo)記具有位點(diǎn)數(shù)量多、多態(tài)性豐富、保守性高和共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、種質(zhì)資源鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等多個(gè)領(lǐng)域[17-19]。目前，應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在魚類種質(zhì)資源研究中取得了一定的進(jìn)展。周莉等[20]用8對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明其中的7對(duì)微衛(wèi)星引物具有多態(tài)性和穩(wěn)定性，適用于異育銀鯽遺傳多樣性研究。吳旭等[21]用10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)長江中下游不同地理種群翹嘴鱖進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明江湖阻隔是造成翹嘴鱖種群遺傳分化的原因之一。MCCONNEL等[22]利用4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)新斯科舍、加拿大、挪威和愛爾蘭4個(gè)地域的大西洋鮭(Salmosalar)進(jìn)行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明這4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有豐富的多態(tài)性，能夠作為大西洋鮭的遺傳標(biāo)記。FERGUSON[23]用微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)冰島的赤眼鱒(Squaliobarbusourriculus)群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明冰島赤眼鱒的遺傳多樣性比其它地區(qū)的赤眼鱒低，顯示出了不同地區(qū)赤眼鱒群體遺傳多樣性的差異。梅秋蘭等[24]開發(fā)了20對(duì)微衛(wèi)星引物并篩選出16對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物，對(duì)翹嘴鱖原種群體和養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性比原種群體低。魯雙慶等[25]利用20對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)翹嘴鱖、大眼鱖、斑鱖和暗鱖(Sinipercaobscura)進(jìn)行物種鑒定分析，結(jié)果表明翹嘴鱖與暗鱖的親緣關(guān)系最近。

翹嘴鱖作為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中重要的經(jīng)濟(jì)品種之一，對(duì)其野生自然群體遺傳多樣性的研究，不僅可以為翹嘴鱖的遺傳選育提供優(yōu)良的品種，而且能夠?qū)σ吧N嘴鱖群體進(jìn)行合理有效的種質(zhì)資源保護(hù)。關(guān)于江蘇省野生翹嘴鱖種群的遺傳多樣性分析尚未見報(bào)道，因此本研究通過SSR標(biāo)記對(duì)江蘇省6個(gè)野生翹嘴鱖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為翹嘴鱖種質(zhì)資源研究和翹嘴鱖育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的翹嘴鱖分別來自太湖、滆湖、洪澤湖、高郵湖、駱馬湖和長江鎮(zhèn)江段，共50尾，其中太湖9尾、滆湖9尾、洪澤湖8尾、高郵湖9尾、駱馬湖9尾、長江6尾。分別取各個(gè)體的鰭條樣，凍干-80 ℃保存(圖1)。

圖1 江蘇省翹嘴鱖采樣地理位置圖Fig.1 Sampling locations ofSiniperca chuatsi in Jiangsu Province

1.2 DNA的提取

將翹嘴鱖鰭條樣品剪碎，并用研缽研碎。取0.1g研碎組織加入500 μLSTE緩沖液(150 mmol·L-1NaCl，50 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1EDTA)，12.5 μL10%SDS，10 μL蛋白酶K(20mgm·L-1)均勻混合。將混合物在55℃恒溫下消化4 h，用苯酚和氯仿萃取后用等體積的異丙醇進(jìn)行沉淀，12 000 r·min-1離心10 min后再用70%乙醇洗滌兩次，用30 μL蒸餾水進(jìn)行溶解。溶解之后用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并保存于4℃冰箱中備用。

1.3 微衛(wèi)星引物

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上的翹嘴鱖核酸序列設(shè)計(jì)了100對(duì)微衛(wèi)星引物，送往上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，合成后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離篩選出了20對(duì)高多態(tài)性的引物(表1)。

1.4 PCR反應(yīng)及電泳分析

構(gòu)建PCR反應(yīng)25 μL體系：1 uL50 ng·μL-1DNA，上、下游引物各0.5 μL，2.5 μL10×buffer(Mg2+)，2 μLdNTPMix，0.25 μLTaq，18.25 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸1 min；最后置于4℃下保存。用瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的條帶。待電泳結(jié)束后，用硝酸銀進(jìn)行染色，染色結(jié)束后進(jìn)行顯色，顯色完成后用相機(jī)拍照并讀取目的條帶基因型，確定等位基因片段大小。

表1 20對(duì)微衛(wèi)星引物的序列和特征Tab.1 Sequences and characteristics of 20 microsatellite primers

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

用popgene32(Version 1.32)軟件統(tǒng)計(jì)所有位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)，以及各群體之間的遺傳相似度和遺傳距離。利用genepopV4.0軟件進(jìn)行哈迪溫伯格平衡測試，檢驗(yàn)不同種群各位點(diǎn)是否平衡。用PIC-CALC軟件分析多態(tài)信息含量(PIC)。用NTsys軟件構(gòu)建不同群體的UPGAM親緣關(guān)系樹。調(diào)查近3年江蘇省各大湖泊和長江的翹嘴鱖放流增殖數(shù)據(jù)并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 6個(gè)翹嘴鱖群體的遺傳多樣性分析

用經(jīng)過篩選的20對(duì)翹嘴鱖微衛(wèi)星引物對(duì)5湖1江的6個(gè)野生翹嘴鱖群體共50個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，每對(duì)引物都能穩(wěn)定擴(kuò)增出明顯微衛(wèi)星條帶，且條帶清晰(圖2)。

在20個(gè)位點(diǎn)中總共獲得839個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因?yàn)?～9個(gè)，且5湖1江的翹嘴鱖群體在每個(gè)位點(diǎn)上都表現(xiàn)出了多態(tài)性。其中長江翹嘴鱖群體的平均有效等位基因?yàn)?.524 8、平均期望雜合度為0.922、多態(tài)信息含量為0.827 3，在6個(gè)翹嘴鱖群體中最高。相反，太湖翹嘴鱖群體的平均有效等位基因?yàn)?.862 3、平均期望雜合度為0.836 9、平均多態(tài)信息含量為0.761 9，在6個(gè)翹嘴鱖群體中最低(表2)。

2.2 哈迪溫伯格平衡測試

在所有6個(gè)野生翹嘴鱖群體的20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Hardy-Weinberg測試中，駱馬湖、滆湖、太湖和長江的所有位點(diǎn)都符合哈迪溫伯格平衡。而在洪澤湖中，S16位點(diǎn)處于不平衡(P<0.05)；在高郵湖中，S6位點(diǎn)顯著不平衡(P<0.01)(表3)。

2.3 5個(gè)湖翹嘴鱖群體的遺傳相似度和遺傳距離

5湖1江翹嘴鱖群體的遺傳相似度和遺傳距離見表4。由表4可知，太湖翹嘴鱖群體和滆湖翹嘴鱖群體之間的遺傳距離(0.062 8)最小，遺傳相似系數(shù)(0.939 1)最高，說明太湖翹嘴鱖群體和滆湖翹嘴鱖群體之間親緣關(guān)系比較近。洪澤湖和高郵湖翹嘴鱖群體之間遺傳距離(0.084 2)也比較小，兩者之間的親緣關(guān)系也比較近。相反，駱馬湖翹嘴鱖群體和太湖翹嘴鱖群體之間的遺傳距離(0.509 6)最大，遺傳相似系數(shù)(0.600 7)最低，其親緣關(guān)系也最遠(yuǎn)。此外，長江與5個(gè)內(nèi)陸湖中的高郵湖翹嘴鱖群體的遺傳距離(0.115 9)最小，表明與其親緣關(guān)系最近。

圖2 S6引物在6個(gè)翹嘴鱖群體中的微衛(wèi)星擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of S6 primers in 6 Siniperca chuatsi groups in the microsatellite注：1～9：駱馬湖群體；10～18：滆湖群體；19～27：太湖群體；28～36：高郵湖群體；37～44：洪澤湖群體；45～50：長江群體； M：Takara 的DNA markerNote：1～9: Loma Lake group; 10～18: Gehu Lake group; 19～27: Taihu Lake group; 28～36: Gaoyou Lake group; 37～44: Hongze Lake group; 45～50: Yangtze River group; M: Takara DNAmarker

遺傳多樣性參數(shù)Genetic diversity parameter駱馬湖Loma Lake滆湖Gehu Lake太湖Taihu Lake高郵湖Gaoyou Lake洪澤湖Hongze Lake長江Yangtze River平均有效等位基因(Ne) Mean effective allele4.887 04.863 24.862 34.9395.143 46.524 8平均觀測雜合度(Ho) Mean observed heterozygosity 0.612 50.722 20.738 90.744 40.811 10.808 3平均期望雜合度(He) Mean expected heterozygosity0.838 50.837 90.836 90.838 90.850 70.922 0平均多態(tài)信息含量(PIC) Mean polymorphism information content0.762 70.762 60.761 90.762 80.776 70.827 3

表3 6個(gè)翹嘴鱖群體所有位點(diǎn)的哈迪溫伯格平衡測試Tab.3 The Hardy-Weinberg equilibrium test of all loci in 6 Siniperca chuatsi populations

注：*表示連鎖不平衡(P<0.05)；**表示顯著不平衡(P<0.01)

Note:*indicates linkage imbalance(P<0.05);**represents a significant imbalance (P<0.01)

表4 6個(gè)野生翹嘴鱖群體之間的遺傳距離和遺傳相似度Tab.4 Genetic distance and genetic similarity among 6 wild populations of Siniperca chuatsi

注：對(duì)角線上方為遺傳相似系數(shù)，對(duì)角線下方為遺傳距離

Note: The genetic similarity coefficient is above the diagonal line, and the genetic distance is below the diagonal line

2.4 聚類分析結(jié)果

根據(jù)表4的6個(gè)野生翹嘴鱖群體的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，對(duì)這6個(gè)群體進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果顯示高郵湖和洪澤湖翹嘴鱖群體先聚為一類，然后和長江聚為一類；另外滆湖和太湖聚為一類。由于高郵湖與洪澤湖之間相互連通，且長江與高郵湖之間也相互連通，故水域之間的連通有可能是影響其聚類的原因(圖3)。

圖3 6個(gè)野生鱖魚群體之間的UPGMA聚類分析Fig.3 UPGMA cluster analysis among 6 wild populations of Siniperca chuatsi

2.5 翹嘴鱖的放流數(shù)據(jù)記錄

根據(jù)2015—2017年江蘇省各個(gè)湖泊的翹嘴鱖放流數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示所有湖泊和長江中只有高郵湖和洪澤湖在3年中每年都放流了翹嘴鱖(表5)。

表5 江蘇省各個(gè)湖泊近3年翹嘴鱖的放流記錄Tab.5 Release records of Siniperca chuatsi from lakes of Jiangsu in recent three years

3 討論

3.1 江蘇省翹嘴鱖群體的遺傳多樣性

微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度的多態(tài)性，與其它分子標(biāo)記相比它能更多的揭示群體的遺傳變異水平，因而微衛(wèi)星標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于群體遺傳多樣性的研究[26-27]。本研究篩選了翹嘴鱖的20個(gè)微衛(wèi)星引物，對(duì)江蘇省5湖1江的野生翹嘴鱖的基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)檢測確定，擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶明顯。群體遺傳多樣性水平的大小主要體現(xiàn)在雜合度和多態(tài)信息含量上，若其數(shù)值越大，則遺傳多樣性越豐富[28]。TAKEZAKI等[29]通過對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雜合度處于0.3以上時(shí)就表明群體具有遺傳多樣性。BOTSTEIN等[30]通過對(duì)多態(tài)信息含量的研究發(fā)現(xiàn)，若多態(tài)信息含量超過0.5，即說明其具有豐富的多態(tài)性。魯雙慶等[25]通過對(duì)湖南省洞庭湖野生翹嘴鱖群體的遺傳多樣性研究表明，洞庭湖野生翹嘴鱖群體的平均期望雜合度為0.64，平均多態(tài)信息含量為0.535 5。在本研究中，江蘇省5個(gè)內(nèi)陸湖和長江的野生翹嘴鱖群體的平均期望雜合度都在0.8以上，平均PIC也都在0.7以上，均高于魯雙慶等[25]的研究結(jié)果，說明江蘇省野生翹嘴鱖群體的遺傳多樣性高于湖南省洞庭湖的野生翹嘴鱖群體。

3.2 翹嘴鱖群體間的親緣關(guān)系

群體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近主要通過群體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離來判斷。群體間的遺傳相似度越大表明親緣關(guān)系越近。當(dāng)遺傳相似系數(shù)大于0.5時(shí)，群體間的親緣關(guān)系就屬于一級(jí)親緣關(guān)系[31]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，6個(gè)翹嘴鱖群體互相之間的遺傳相似指數(shù)都符合了一級(jí)親緣關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)。其中，太湖翹嘴鱖和滆湖翹嘴鱖兩個(gè)群體間的遺傳相似度最大，為0.939 1，駱馬湖翹嘴鱖與太湖翹嘴鱖兩個(gè)群體的遺傳相似度最小，為0.600 7。親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近有可能與地理位置有關(guān)，朱滔等[32]通過對(duì)赤壁、常德和懷化3個(gè)地域的野生翹嘴鱖群體遺傳多樣性研究表明翹嘴鱖群體間的親緣關(guān)系和翹嘴鱖群體的地理位置分布相關(guān)。在本研究中，太湖與滆湖之間的距離最近，所以遺傳相似度最大，親緣關(guān)系最近，而太湖與駱馬湖的距離最遠(yuǎn)，親緣關(guān)系也最遠(yuǎn)，這與朱滔等[32]的研究結(jié)果一致，表明了相同物種之間的親緣關(guān)系與地理位置的分布相關(guān)。

3.3 哈迪溫伯格平衡分析及放流影響

哈迪溫伯格定律是指在理想狀態(tài)下，各等位基因的頻率和等位基因的基因型頻率在遺傳中是穩(wěn)定不變的，即保持著基因平衡[33-34]。在該研究中，所有種群的位點(diǎn)中只有2個(gè)位點(diǎn)上偏離了平衡(P<0.05)，分別是S6位點(diǎn)和S16位點(diǎn)，洪澤湖和高郵湖分別在這兩個(gè)位點(diǎn)上表現(xiàn)出了不平衡和顯著不平衡，表明了洪澤湖和高郵湖的翹嘴鱖群體出現(xiàn)了遺傳不平衡。從近3年翹嘴鱖的放流數(shù)據(jù)可以看出，只有洪澤湖和高郵湖放流了翹嘴鱖，但放流的數(shù)量不是很大且高郵湖比洪澤湖放流稍微多一些，這與位點(diǎn)不平衡相對(duì)應(yīng)，因?yàn)榉帕鲾?shù)量少，所以只有兩個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)了不平衡，說明翹嘴鱖的放流會(huì)影響當(dāng)?shù)芈N嘴鱖野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了遺傳不平衡。把翹嘴鱖放流數(shù)據(jù)與遺傳多樣性相結(jié)合起來分析，除長江野生翹嘴鱖群體特別高以外，另外5個(gè)湖都相差不多，其中高郵湖和洪澤湖稍高，而恰恰高郵湖和洪澤湖進(jìn)行了翹嘴鱖放流，這進(jìn)一步說明翹嘴鱖的放流有可能會(huì)影響水域翹嘴鱖野生群體的遺傳多樣性。

4 小結(jié)

1)在江蘇省6個(gè)翹嘴鱖群體中，長江翹嘴鱖群體的遺傳多樣性最高，太湖翹嘴鱖群體的遺傳多樣性最低。

2)翹嘴鱖群體之間的親緣關(guān)系與群體分布的地理位置相關(guān)。

3)翹嘴鱖的放流可能會(huì)影響當(dāng)?shù)芈N嘴鱖群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性。