鐘澤艷， 陳劍虹， 官志揚(yáng)， 賀海林， 鐘國(guó)興， 楊坤祥

惠州市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心產(chǎn)前診斷中心(廣東惠州 516007)

β地中海貧血(以下簡(jiǎn)稱β地貧)是我國(guó)南方最常見(jiàn)的單基因遺傳病之一，是一種由于珠蛋白基因表達(dá)缺陷導(dǎo)致的珠蛋白鏈合成減少或缺如的溶血性貧血疾病[1]。β珠蛋白基因簇位于11號(hào)常染色體的短臂，常見(jiàn)的β地貧主要是由于β珠蛋白基因簇的點(diǎn)突變引起，只有少數(shù)是因β珠蛋白基因簇的大片段缺失(稱β缺失型地貧)。β缺失型地貧主要見(jiàn)于δβ地貧，其特征是由于基因發(fā)育表達(dá)失控引起的胎兒出生后血紅蛋白F(hemoglobin,HbF)持續(xù)增高，且存在遺傳異質(zhì)性大[2-3]。研究報(bào)道，在我國(guó)最常見(jiàn)的β缺失型地貧主要有3種，分別為東南亞型HPFH(SEA-HPFH)、中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0、中國(guó)臺(tái)灣型(Taiwanese)[2-4]。在廣東省的大樣本地貧基因攜帶率的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，惠州地區(qū)的地貧基因攜帶率(17.50%)明顯高于全省的平均水平(16.83%)[5]。因此，地貧防控的有效實(shí)施與完善對(duì)于提高惠州市人口的健康水平和質(zhì)量具有重大意義。本研究利用廣東省孕前和孕期優(yōu)生健康檢查信息管理平臺(tái)，以惠州市政府“民生工程”為背景，分析惠州地區(qū)育齡夫婦人群中SEA-HPFH、中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0和Taiwanese缺失地貧的基因攜帶率及臨床特征等流行病學(xué)資料，完善惠州地區(qū)人群地貧防控模式，為本市的優(yōu)生優(yōu)育工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年10月至2017年11月，參加惠州市孕前和孕期優(yōu)生健康檢查的育齡夫婦，通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及知情同意的原則，符合免費(fèi)政策要求在本院進(jìn)行地貧基因分析的受檢者39 170例。年齡(26±5.31)歲，近3個(gè)月無(wú)輸血史，均來(lái)源于惠州市的六大縣區(qū)(惠城區(qū)、惠東縣、博羅縣、龍門縣、大亞灣和仲愷高新區(qū))。

1.2 樣本采集 在知情同意的原則下，抽取受檢者外周血兩管(2 mL/管)，一管使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，用于血常規(guī)檢測(cè)。一管使用枸櫞酸鈉(ACD)抗凝，用于血紅蛋白(hemoglobin，Hb)電泳分析和地貧基因分析。同時(shí)，本中心對(duì)可能會(huì)分娩中、重型地貧患兒的孕婦行產(chǎn)前診斷。

1.3 研究方法

1.3.1 血常規(guī)檢測(cè) 采用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司的BC-5380全自動(dòng)五分類血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞參數(shù)，包括Hb、紅細(xì)胞平均體積 (mean corpuscular volume，MCV)及紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量 (mean corpuscular hemoglobin，MCH)等。采用廠家原裝配套試劑，其中外院樣本的血常規(guī)檢測(cè)在當(dāng)?shù)貐^(qū)縣的醫(yī)院完成并將數(shù)據(jù)報(bào)送我院。

1.3.2 Hb電泳分析 采用法國(guó)Sebia公司的Capillarys 2 flex piercing全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀分析Hb組分。分析內(nèi)容主要包括血紅蛋白A(hemoglobin A，HbA)、血紅蛋白A2(hemoglobin A2，HbA2)和HbF等。當(dāng)HbA2>3.50%和(或)HbF>2.50%，判定為β地貧表型陽(yáng)性[5-6]。采用廠家原裝配套試劑，其中部分外院樣本的Hb電泳分析在當(dāng)?shù)貐^(qū)縣的醫(yī)院完成并將數(shù)據(jù)報(bào)送我院。正常參考值：Hb為120～160 g/L(男)、110～150 g/L(女)，MCV為82～100 fL，MCH為27～34 pg，HbA2為2.5%～3.5%，HbF<2.5%。

1.3.3 地貧基因分析 按全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書，采用廈門百維信生物公司的Lab-Aid 820 核酸提取儀提取基因組DNA。獲得的DNA應(yīng)用亞能生物技術(shù)有限公司和中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的地貧基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行基因檢測(cè)。檢測(cè)范圍為中國(guó)人常見(jiàn)的3種α缺失型地貧(--SEA/、-α4.2/、-α3.7/)，3種α非缺失型地貧(HBA2:c.369C>G、HBA2:c.377T>C、HBA2:c.427T>C)，17種β地貧(HBB:c.126_129delCTTT、HBB:c.52A>T、HBB:c.130G>T、HBB:c.216_217insT、HBB:c.92+1G>T、HBB:c.92+5G>C、HBB:c.316-197C>T、HBB:c.-78A>C、HBB:c.-79A>G、HBB:c.-80T>C、HBB:c.-82C>A、HBB:c.-11_-8delAAAC、HBB:c.2T>G、HBB:c.45_46insG、HBB:c.84_85insC、HBB:c.79G>A、HBB:c.94delC)。按照操作說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判斷。對(duì)疑為β地貧而未檢出常見(jiàn)突變基因的樣本，進(jìn)一步采用裂縫聚合酶鏈反應(yīng)(Gap polymerase chain reaction, Gap-PCR)技術(shù)檢測(cè)SEA-HPFH缺失、中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失、Taiwanese缺失，目的片段長(zhǎng)度分別為420、330、670 bp。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)基因型及β缺失型地貧結(jié)果 在39 170例血液樣本中，根據(jù)血液學(xué)篩查陽(yáng)性樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)，判定為β地貧表型陽(yáng)性而未檢出常規(guī)基因型的樣本有364例，所占比例為0.93%。在364例加測(cè)樣本中檢出β缺失型地貧105例，檢出率為0.27%。包括SEA-HPFH缺失62例，中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失41例和Taiwanese缺失2例，其中復(fù)合α地貧有13例。其中檢出6例樣本的配偶同為β地貧攜帶者，屬夫妻同型地貧攜帶者，進(jìn)行產(chǎn)前診斷。具體結(jié)果和基因型別見(jiàn)圖1、表1。

2.2 β缺失型地貧攜帶者的血液學(xué)特征 3種β缺失型地貧攜帶者的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果均表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素，但貧血癥狀較輕或無(wú)貧血。Hb電泳分析：SEA-HPFH缺失地貧攜帶者大部分樣本的HbA2高于正常值3.5%，HbF呈現(xiàn)明顯增高；但中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧攜帶者則不同于常見(jiàn)β地貧點(diǎn)突變攜帶者，全部表現(xiàn)為HbA2不增高，而HbF與SEA-HPFH缺失地貧攜帶者一樣明顯增高；與前兩者不一樣，Taiwanese缺失地貧攜帶者雖然HbA2增高，但HbF沒(méi)有明顯的增高。見(jiàn)表2。

1：Marker,2～4：樣本；5：陰性對(duì)照；6～8：陽(yáng)性對(duì)照；9：空白對(duì)照

圖1 β缺失型地貧電泳結(jié)果

2.3 不同組別的血液學(xué)特征 比較SEA-HPFH缺失雜合子和中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失雜合子的血液學(xué)特征，通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，6組數(shù)據(jù)除了HbA2為非正態(tài)分布，其余5組數(shù)據(jù)均為正態(tài)性分布。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，HbA2數(shù)據(jù)組的U值為176.00(P=0.000)，其余5組數(shù)據(jù)組詳見(jiàn)表3。比較分析發(fā)現(xiàn)，除了Hb數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他包括MCV、MCH、HbA、HbA2和HbF的5組數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 β缺失型地貧基因型分布

β-1為SEA-HPFH，β-2為Gγ(Aγδβ)0，β-3為Taiwanese

項(xiàng)目例數(shù)Hb(g/L)MCV(fL)MCH(pg)HbA(%)HbA2(%)HbF(%)SEA-HPFH缺失62129.23±17.4677.27±5.7125.44±1.8277.61±5.983.68±0.7918.71±6.08Gγ(Aγδβ)0缺失41128.32±15.6772.64±5.1624.05±2.2682.55±4.842.42±0.3115.03±4.89Taiwanese缺失2115.00±8.4971.85±7.1422.75±3.1891.31±0.045.09±1.413.60±1.37

項(xiàng)目例數(shù)Hb(g/L)MCV(fL)MCH(pg)HbA(%)HbF(%)SEA-HPFH雜合子54130.05±17.4978.16±5.4825.76±1.7177.09±6.1919.31±6.25Gγ(Aγδβ)0雜合子36127.89±15.5272.64±5.3423.98±2.3882.58±5.0615.02±5.12U值0.5994.7274.121-4.6043.430P值0.5510.0000.0000.0000.001

3 討論

δβ地貧屬于β缺失型地貧，是一組血紅蛋白病。β缺失型地貧雜合子與β地貧點(diǎn)突變雜合子婚配后，有1/4的機(jī)會(huì)可能生育中、重型β地貧患兒的風(fēng)險(xiǎn)，是地貧防控的重點(diǎn)類型[7-8]。目前通過(guò)人群篩查，對(duì)同型夫婦這類高風(fēng)險(xiǎn)家庭行產(chǎn)前診斷，防止中、重型地貧患兒的出生，是目前國(guó)內(nèi)公認(rèn)的首選有效措施。

本研究中，惠州地區(qū)39 170例樣本中檢出105例β缺失型地貧患者，攜帶率高達(dá)0.27%。其中SEA-HPFH占59.05%，中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0占39.05%和Taiwanese占1.90%。β缺失型地貧攜帶者的紅細(xì)胞參數(shù)結(jié)果表現(xiàn)為無(wú)貧血或輕度貧血，Hb為109～161 g/L，但有明顯的小細(xì)胞低色素特征，MCV、MCH顯著下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相類似[7-10]。在Hb電泳結(jié)果中，SEA-HPFH和中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧攜帶者都表現(xiàn)了明顯的高水平HbF(5.15%～36.48%)。與常見(jiàn)β地貧點(diǎn)突變攜帶者[11-13]相比較，SEA-HPFH缺失地貧攜帶者大部分的HbA2升高，但中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧攜帶者卻表現(xiàn)出HbA2不增高。該明顯的血液學(xué)特征與前期文獻(xiàn)報(bào)道的一致[2,6-7,14]，且血液學(xué)參數(shù)范圍更大。分析原因，除了因存在個(gè)體差異性大，可能由于大樣本研究，樣本來(lái)源較多地區(qū)，血液學(xué)檢查的質(zhì)控和所用儀器存在一定的差異性。此外，研究發(fā)現(xiàn)SEA-HPFH和中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧主要收集于惠東縣、博羅縣和惠城區(qū)3個(gè)地區(qū)，特別是惠東縣的檢出率明顯高于其他地區(qū)，可能因地區(qū)人群差異性所導(dǎo)致?；輺|縣人口組成以客家人為主，這支持了前期報(bào)道的“地貧主要分布于客家人，隨著客家人祖先的南遷和漂泊傳遞到世界地區(qū)”的推論[15]。與前兩者不一樣，Taiwanese缺失地貧攜帶者雖然HbA2增高，但HbF沒(méi)有明顯的增高。不過(guò)因該基因型別檢出樣本例數(shù)較小，血液學(xué)特征需后期獲取更多的陽(yáng)性樣本進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析SEA-HPFH缺失雜合子和中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失雜合子的血液學(xué)特征，6組數(shù)據(jù)中除了Hb組的其他組數(shù)據(jù)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與早期的報(bào)道情況一致。

本研究中，3種β缺失型地貧患者的臨床癥狀較輕，其中13例復(fù)合了α地貧的樣本臨床癥狀更是有所緩解，但當(dāng)復(fù)合其他β地貧時(shí)，患者會(huì)出現(xiàn)中度至重度貧血，臨床表型類似于中、重型β地貧[9-10,16]。因此，檢測(cè)出6例為SEA-HPFH和中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧且其配偶同為β地貧者，在知情同意情況下均行產(chǎn)前診斷，分別檢測(cè)出3例正常胎兒、2例β地貧攜帶者及1例中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧復(fù)合β地貧雙重雜合子胎兒。其中復(fù)合β地貧的胎兒經(jīng)遺傳咨詢后，該例患者選擇終止妊娠。雖然中國(guó)人群中，β地貧主要是因β珠蛋白基因的點(diǎn)突變所致，但本研究發(fā)現(xiàn)惠州地區(qū)人群的β缺失型地貧攜帶率也不低，特別是SEA-HPFH和中國(guó)型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧是比較常見(jiàn)的類型。目前國(guó)內(nèi)各分子實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用的基因檢測(cè)技術(shù)僅檢測(cè)17種點(diǎn)突變引起的β地貧，不包括β缺失型地貧。對(duì)于β缺失型地貧會(huì)漏診，從而導(dǎo)致中、重型β地貧患兒的出生。因此，若篩查中血液學(xué)參數(shù)顯示為小細(xì)胞低色素性貧血，而常規(guī)地貧基因未檢出，并伴有HbF明顯升高，尤其是當(dāng)HbF>5%時(shí)，應(yīng)考慮β缺失型地貧的可能[6-7]。同理，一個(gè)家系中只檢測(cè)出一個(gè)常規(guī)地貧基因突變，卻生育出了重型β地貧患兒，應(yīng)考慮β缺失型地貧的可能?？傊?，在臨床遺傳咨詢中要嚴(yán)格遵循血液學(xué)表型與基因型相結(jié)合的分析原則，并注意和重視β缺失型地貧的篩查及診斷，預(yù)防誤診或漏診，保證臨床診斷的準(zhǔn)確性。

綜上所述，惠州地區(qū)β缺失型地貧攜帶率高，地貧防控應(yīng)同時(shí)行血常規(guī)檢測(cè)和Hb電泳分析。針對(duì)于β缺失型地貧的正確診斷，可為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供更好的依據(jù)。本研究中，采集樣本量較多，來(lái)源較廣，檢測(cè)質(zhì)量的把控需進(jìn)一步完善統(tǒng)一的管理文件，且惠州地區(qū)存在多種民族，對(duì)于少數(shù)民族的基因型特征分布情況有待進(jìn)一步研究，完善地貧數(shù)據(jù)庫(kù)。