郭文慧， 潘云， 李艷△

1大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室(云南大理 671000)； 2大理大學(xué)附屬醫(yī)院病理科(云南大理 671000)

轉(zhuǎn)移是大多數(shù)癌癥患者預(yù)后不良和癌癥相關(guān)性死亡的主要原因,是由Ashworth[1]首次提出的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)離開原發(fā)和(或)繼發(fā)腫瘤微環(huán)境，并滲入循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)而引起，所以針對(duì)CTCs的檢測(cè)和治療受到了研究者的廣泛關(guān)注。但因CTCs富集技術(shù)的缺乏，其應(yīng)用一直受到限制。直到近20年間，隨著CTCs分離純化技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，其潛在臨床應(yīng)用才逐漸被發(fā)掘出來(lái)。近年來(lái)，大量研究已表明CTCs檢測(cè)可用于輔助癌癥的早期診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后及監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，可很好地反映腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等情況。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)使用CellSearch計(jì)數(shù)CTCs作為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)的預(yù)后生物標(biāo)志物。還有研究也表明CTCs分析可用于檢測(cè)各種癌癥的早期腫瘤進(jìn)展，如乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌等[2-5]。但CTCs在癌癥治療中的研究，國(guó)內(nèi)已報(bào)道的綜述文獻(xiàn)大多是關(guān)于CTCs計(jì)數(shù)對(duì)治療療效的監(jiān)測(cè)評(píng)估，本文就CTCs的分子分析和靶向CTCs兩方面對(duì)癌癥治療的研究進(jìn)展作一綜述，其主要內(nèi)容為：通過追蹤C(jī)TCs的分子生物學(xué)變化，揭示重要的抗腫瘤藥物敏感性信息和耐藥情況，在個(gè)性化基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)治療方案的迅速調(diào)整；通過靶向轉(zhuǎn)移過程中CTCs，干擾腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移或影響CTCs回巢后的腫瘤生長(zhǎng)，改善患者預(yù)后或減少轉(zhuǎn)移相關(guān)性癌癥死亡，為下一代癌癥患者抗轉(zhuǎn)移治療的發(fā)展提供可能。

1 CTCs指導(dǎo)個(gè)體化醫(yī)療

傳統(tǒng)活檢和影像成像是診斷腫瘤最常用的方法，一直以來(lái)，治療方案的選擇都脫離不了實(shí)體腫瘤病灶檢查的局限性[6]。但CTCs作為腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”，存在于血液循環(huán)系統(tǒng)中，可被簡(jiǎn)便、微創(chuàng)和可重復(fù)性地檢查，解決了以上局限。另外，常常在治療初期各抗腫瘤藥物的療效較好，可最終大部分腫瘤產(chǎn)生了耐藥性，而耐藥突變的出現(xiàn)往往造成患者的預(yù)后不良。CTCs分析的發(fā)展，可通過檢測(cè)CTCs的DNA、RNA和蛋白質(zhì)組分實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展，為針對(duì)腫瘤產(chǎn)生的新突變和隨之產(chǎn)生的耐藥性，確定最有效的治療方案。再者，近年來(lái)隨著CTCs體內(nèi)外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，使基于CTCs的藥敏實(shí)驗(yàn)成為可能，從而大大提高了治療方案的有效性。

1.1 通過檢測(cè)CTCs的分子生物學(xué)特性制定和調(diào)整治療方案 曲妥珠單抗作為乳腺癌患者的靶向藥物，目前，只是HER-2擴(kuò)增型乳腺癌標(biāo)準(zhǔn)治療的部分，但從CTCs分子分析的角度來(lái)看，原發(fā)性HER-2陰性乳腺癌也可能從中受益。大量研究表明，在原發(fā)性HER-2陰性乳腺癌患者中，可檢測(cè)到HER-2陽(yáng)性的CTCs[7-8]。2期臨床試驗(yàn)就以CTCs HER-2基因擴(kuò)增為依據(jù)，對(duì)原發(fā)性HER-2陰性的乳腺癌患者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性曲妥珠單抗治療，發(fā)現(xiàn)其可延長(zhǎng)此類患者的PFS[9]。前瞻性3期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)治療組和標(biāo)準(zhǔn)治療聯(lián)合拉帕替尼(HER-2蛋白酪氨酸激酶抑制劑)治療組，來(lái)探討原發(fā)性HER-2陰性、CTCs HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者能否從抗HER-2治療中獲益[10]。如果可以，則CTCs HER-2的基因或蛋白分子檢測(cè)就可為乳腺癌的患者提供更全面的治療策略。除HER-2外，Mazel等[11]首次在乳腺癌的CTCs中檢查到細(xì)胞程式死亡-1(PD-L1)，此為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)，可為患者選擇免疫療法，并在免疫治療期間實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。Paoletti等[12]也通過監(jiān)測(cè)CTCs中ER的基因及表達(dá)情況，來(lái)作為乳腺癌內(nèi)分泌治療的工具。

吉非替尼是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的一線靶向藥物，可選擇性抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶。目前，研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼耐藥的NSCLC中有50%歸因于EGFR T790M突變[13]。Jiang等[14]在NSCLC患者的原發(fā)組織和CTCs中測(cè)定了EGFR的特定突變位點(diǎn)：19-Del、L858R、T790M、20-Ins、G719X、S768I和L861Q，發(fā)現(xiàn)兩者中EGFR的突變幾乎一致，且發(fā)現(xiàn)吉非替尼治療有效或成功的患者，CTCs EGFR中無(wú)T790M突變，而耐藥患者CTCs中可檢出T790M突變。此實(shí)驗(yàn)揭示了CTCs檢測(cè)可代替原發(fā)組織活檢，通過測(cè)定CTCs EGFR突變，可及時(shí)調(diào)整靶向治療方案，避免無(wú)效治療。除EGFR亞型外，間變性淋巴瘤激酶(ALK)重排是NSCLC的又一不同亞型。Kim等[15]使用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測(cè)了ALK重排NSCLC患者中的CTCs，發(fā)現(xiàn)分析CTCs中的ALK重排可能是預(yù)測(cè)ALK抑制劑克唑替尼耐藥性和選擇色瑞替尼(克唑替尼耐藥患者的ALK抑制劑)治療的有用方法。Ilié等[16]研究了CTCs和循環(huán)白細(xì)胞中的PD-L1狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)與腫瘤組織中的PD-L1狀態(tài)相關(guān)，揭示了連續(xù)CTCs監(jiān)測(cè)在腫瘤免疫療法選擇中的重要作用。

除以上介紹的乳腺癌和NSCLC外，CTCs的分子生物學(xué)特性檢測(cè)在其他癌癥中也有類似的作用。如在卵巢癌的鉑類耐藥患者中，外周CTCs中可檢出一組與化療耐藥相關(guān)的蛋白，即多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-related proteins 1～10，MRP 1～10)和核糖核苷酸還原酶亞基 M1(ribonucleotide reductase subunit M1，RRM1)，這組蛋白可為治療耐藥性卵巢癌提供前景靶點(diǎn)[17]。再者，Braun等[18]首次證實(shí)了EGFR蛋白在肉瘤患者CTCs中的表達(dá)，表明了可通過隨訪CTCs中EGFR的表達(dá)情況來(lái)評(píng)估靶向EGFR治療的療效，為疾病過程中及時(shí)調(diào)整患者的治療方案做準(zhǔn)備。

1.2 通過CTCs細(xì)胞培養(yǎng)的藥敏測(cè)試 研究表明，在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌中已經(jīng)建立了CTCs細(xì)胞系[19-22]，且有些亞型可以在小鼠的臨床實(shí)驗(yàn)中致瘤。2014年，Yu等[20]報(bào)道了一項(xiàng)具有里程碑意義的研究，他們?cè)?例患有ER陽(yáng)性乳腺癌的患者中分離出CTCs，通過體外懸浮培養(yǎng)，建立了CTCs細(xì)胞系和小鼠原位移植瘤模型。又采用體外細(xì)胞培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)和DNA二代測(cè)序，證實(shí)了CTCs中PIK3CA突變者對(duì)BYL719敏感，F(xiàn)GFR2突變者對(duì)AZD4547敏感，ESR1突變者對(duì)他莫昔芬及氟維司群均耐藥，但聯(lián)合HSP90抑制劑則可取得很好的效果。此結(jié)果揭示了乳腺癌藥物敏感性與CTCs 基因突變的相關(guān)性，可以幫助鑒定個(gè)體乳腺癌患者在其疾病過程中的最佳療法。2015年，Cayrefourcq等[21]成功培育出結(jié)直腸癌CTCs的第1株永久細(xì)胞株，且在免疫缺陷小鼠中形成了異種移植腫瘤，為進(jìn)一步體內(nèi)外進(jìn)行大量藥敏測(cè)試的功能研究提供了條件，將更好地實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療。另外，Zhang等[23]利用芯片捕獲的肝癌CTCs在三維細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中擴(kuò)增形成了球狀結(jié)構(gòu)，且在藥敏測(cè)試中發(fā)現(xiàn)了索拉非尼或奧沙利鉑可顯著地抑制CTCs的克隆。此外，在一項(xiàng)預(yù)測(cè)和評(píng)估紫杉醇-卡鉑治療上皮性卵巢癌療效的研究中，研究者利用體外培養(yǎng)CTCs測(cè)試藥敏來(lái)評(píng)估CTCs對(duì)紫杉醇-卡鉑的敏感度與患者療效反應(yīng)之間的相關(guān)性。根據(jù)患者的治療史和隨訪可知，當(dāng)CTCs對(duì)紫杉醇-卡鉑敏感時(shí)，患者病情緩解或?qū)熡蟹磻?yīng)；而當(dāng)CTCs對(duì)紫杉醇-卡鉑耐藥時(shí)，患者復(fù)發(fā)[24]。此實(shí)驗(yàn)表明可通過體外CTCs的藥敏實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估療效并及時(shí)為疾病過程中的個(gè)體患者更換療法。

2 針對(duì)CTCs的癌癥治療方法

CTCs處在整個(gè)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散過程的中心環(huán)節(jié)上，若將其作為一個(gè)新靶點(diǎn)，可干擾癌癥的轉(zhuǎn)移，為癌癥治療提供新方案。

2.1 靶向清除CTCs 自然殺傷細(xì)胞表面的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，這是機(jī)體對(duì)腫瘤發(fā)生的重要免疫手段。通過把TRAIL修飾的脂質(zhì)體整合到與CTCs結(jié)合的循環(huán)細(xì)胞和血液成分中，從而誘導(dǎo)CTCs的凋亡是一種腫瘤治療的新嘗試。Wayne等[25]把修飾的脂質(zhì)體附著到循環(huán)白細(xì)胞上，使這些白細(xì)胞變成循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的“非自然殺傷細(xì)胞”，誘導(dǎo)它們接觸的CTCs發(fā)生凋亡。Li等[26]通過同樣的方法，依據(jù)CTCs與血小板的相互作用，建立了血小板靶向脂質(zhì)體。他們通過功能化轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型小鼠中的血小板以清除CTCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血小板上表達(dá)TRAIL的小鼠肺轉(zhuǎn)移明顯減少。同樣地，Chandrasekaran等[27]創(chuàng)建了TRAIL修飾的NK細(xì)胞脂質(zhì)體，以增強(qiáng)NK細(xì)胞的內(nèi)在腫瘤抑制能力，使NK細(xì)胞對(duì)CTCs的殺傷力增強(qiáng)，并有效地防止原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，納米激光探針可檢測(cè)和追蹤循環(huán)中的CTCs，并可通過發(fā)射高功率激光脈沖殺滅CTCs，但不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成破壞，這可有效控制癌癥轉(zhuǎn)移，有望成為減少轉(zhuǎn)移相關(guān)性癌癥死亡的前景手段[28]。然而，這種創(chuàng)新方法的可行性和安全性，還需要未來(lái)臨床試驗(yàn)的證明。特別是，評(píng)估殺死轉(zhuǎn)運(yùn)CTCs是否對(duì)已建立的臨床結(jié)果參數(shù)，如PFS和OS有影響?？梢栽O(shè)想，對(duì)于不可手術(shù)但沒有總轉(zhuǎn)移跡象的癌癥患者來(lái)說(shuō)，殺滅CTCs、停止進(jìn)一步血液播散可能會(huì)使其受益。另外，Mirza等[29]的研究也表明，姜黃素可通過誘導(dǎo)DNA損傷或抑制DNA修復(fù)靶向循環(huán)肺癌干細(xì)胞，從而減緩NSCLC的疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。

2.2 通過CTCs殺死原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞 最近的研究表明，CTCs可以從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性病灶轉(zhuǎn)移到外周血，然后通過稱為“自我播種”的過程回到原發(fā)腫瘤或繼發(fā)腫瘤，從而促進(jìn)原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移性傳播[30]。Dondossola等[31]利用了這種生物學(xué)屬性，將腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通過CTCs直接傳遞給原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤，來(lái)實(shí)現(xiàn)“腫瘤自我靶向”。他們通過基因工程的設(shè)計(jì)，使從乳腺癌、黑素瘤和Lewis肺癌小鼠中提取的CTCs表達(dá)TNF-α，然后回輸?shù)叫∈篌w內(nèi)，在一系列干預(yù)試驗(yàn)后，觀察到CTCs可以定位到腫瘤上，且在表達(dá)TNF-α的腫瘤細(xì)胞小鼠中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性腫瘤灶和轉(zhuǎn)移性集落的生長(zhǎng)有所減緩或減少。此實(shí)驗(yàn)雖然在其他許多腫瘤模型中還未進(jìn)行過測(cè)試，但也給以CTCs為中介的癌癥治療帶來(lái)了曙光。

3 展望

以上主要論述了CTCs分析在個(gè)體化醫(yī)療中的貢獻(xiàn)，以及CTCs作為靶點(diǎn)在癌癥治療中的潛力。未來(lái)該領(lǐng)域的發(fā)展，需要改善培養(yǎng)環(huán)境來(lái)體外培養(yǎng)各種腫瘤CTCs，實(shí)現(xiàn)CTCs高通量基因突變分析，建立CTCs亞型的轉(zhuǎn)移性動(dòng)物模型，為克服耐藥性、推定新藥療效及早期臨床試驗(yàn)機(jī)制提供證據(jù)，為藥物干擾轉(zhuǎn)移試驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)對(duì)象，潛在地推動(dòng)轉(zhuǎn)移過程中的癌癥治療的進(jìn)一步發(fā)展。除此以外，CTCs在臨床早期診斷中的作用也是一大熱點(diǎn)，尤其是腫瘤的定位診斷。眾所周知，現(xiàn)有CTCs的化學(xué)富集是通過一些在血細(xì)胞中不表達(dá)，但在腫瘤細(xì)胞上陽(yáng)性表達(dá)的上皮細(xì)胞表型來(lái)實(shí)現(xiàn)，但卻不能鑒定所捕獲CTCs的組織與器官來(lái)源。Lu等[32]把常規(guī)用來(lái)鑒定特定腫瘤起源的不同種類標(biāo)記物，應(yīng)用于CTCs表征，將從肺癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌外周血中捕獲的CTCs洗脫至由6組抗體組成的免疫熒光染色組：anti-panCK、anti-CK18、anti-CK7、anti-TTF-1、anti-CK20/anti-CDX2、and anti-PSA/anti-PSMA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK7+或TTF-1+、CK20/CDX2+和PSA/PSMA+的CTCs分別對(duì)應(yīng)于肺癌、結(jié)腸直腸癌或前列腺癌，給早期確診腫瘤原發(fā)灶帶來(lái)了新的可能。未來(lái)可在此基礎(chǔ)上發(fā)展敏感度、特異度高的技術(shù)方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)早期、精準(zhǔn)診斷腫瘤，提高患者的治愈率及降低病死率。