李 杰，石元亮，王玲莉，孫 毅，李 忠，魏占波，石淏心

（1 中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧沈陽 110016；2 吉林農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，吉林長春 130033）

水稻是世界上主要的糧食作物，是50%人口的主要口糧。據(jù)統(tǒng)計，2017年我國水稻播種面積為3020萬hm2(4.53億畝)，約占全國糧食播種總面積的26.1%[1]。提高水稻綜合生產(chǎn)能力，是保障我國糧食安全的長期戰(zhàn)略目標。氧化亞氮(N2O)是導致全球氣候變暖的重要溫室氣體之一[2]。雖然大氣中N2O的濃度遠低于二氧化碳(CO2)，但其增溫潛勢卻是CO2的296倍[3]。為了獲得水稻高產(chǎn)，中國農(nóng)田化肥的投入量在持續(xù)增加。淹水種植條件下的稻田土壤利于反硝化作用的發(fā)生，導致N2O的產(chǎn)生和排放。研究結果顯示我國水稻田N2O排放量約占農(nóng)田總排放量的22%，被認為是大氣中N2O的重要排放源之一[4]。因此，減少稻田溫室氣體排放已成為農(nóng)業(yè)排放源中的研究熱點。

目前，為了提高肥料利用率和保護稻田生態(tài)環(huán)境，人們通過在肥料中添加硝化抑制劑來減少氮素損失。市場化的硝化抑制劑主要有兩種，雙氰胺(DCD)和3, 4-二甲基吡唑磷酸鹽(DMPP)。DCD和DMPP的作用機理不同，DCD主要通過干擾AOB對底物的利用來影響硝化作用，而DMPP則通過引起親核取代活性和降低相鄰N的pKa來影響硝化作用[5]。大量研究表明DCD和DMPP在不同類型農(nóng)田和草地土壤中均能很好地抑制硝化作用過程，減少N2O排放和硝酸鹽淋溶[5-7]。但是，目前硝化抑制劑在長期淹水條件下的北方水稻黑土中對硝化作用影響和作用機理的研究尚不多見。因此，評估硝化抑制劑對水稻土壤的硝化抑制效果，對于減少溫室氣體排放和硝酸鹽淋溶，實現(xiàn)氮肥的高效利用具有重要的意義。

本研究以寒地黑土區(qū)水稻土為研究對象，通過分子生物學手段探討氮肥在土壤中的轉化過程，硝化抑制劑DCD和DMPP對氮素循環(huán)關鍵功能微生物的抑制效果及其與氮素轉化動態(tài)的聯(lián)系機制。從而為水稻生產(chǎn)中氮肥合理施用，評估硝化抑制劑在北方水稻黑土上的應用效果和提高氮肥利用效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗土壤采自黑龍江省方正縣水稻科技園區(qū)(116°23′E、39°54′N)的水稻土。土壤類型為草甸黑土，土壤有機質25.8 g/kg、堿解氮187.56 mg/kg、有效磷23.6 mg/kg、速效鉀213 mg/kg，pH為6.1。土壤采集時間為2018年10月30日。將鮮土采回實驗室后，剔除殘留根系，過2 mm篩，25℃培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)兩周待用(將土壤放入培養(yǎng)容器中，不做任何處理，用以恢復土壤微生物活性)。供試氮肥為分析純試劑尿素，硝化抑制劑雙氰胺(DCD)和3, 4-二甲基吡唑磷酸鹽(DMPP)均為分析純，純度分別為99.5%和97%。

1.2 試驗設計

采用室內(nèi)培養(yǎng)方法，尿素施用量為N 0.8 g/kg干土，DCD與DMPP添加量為尿素純氮量的2%和0.5%。設置如下4個處理：對照(CK)；單施尿素處理(Urea)；尿素+DCD(Urea+DCD)；尿素+DMPP(Urea+DMPP)。

試驗分為兩部分。一部分土壤采用300 mL培養(yǎng)瓶裝土，每瓶裝100 g風干土(過2 mm篩)，調(diào)節(jié)水分至淹水條件，使土面上保持2～3 cm的水層(在整個培養(yǎng)時期)。將尿素和硝化抑制劑均勻施入到相應處理的土壤中，透氣膜封口后25℃下恒溫恒濕培養(yǎng)，每個處理4次重復。于培養(yǎng)的第1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、100、122、137、150天采集氣體樣品。另外一部分土壤采用植物培養(yǎng)皿裝土，培養(yǎng)方法和條件同上。分別于1、3、5、9、16、23、30、37、44、59、73、90、100、122、150天破壞性采樣。土壤樣品一式兩份保存，一份于-80℃保存，用于分子微生物分析；另一份于-20℃保存，用于速效氮測定。

1.3 項目測定

1.3.1 氣體樣品采集和測定方法 測定瓶內(nèi)N2O含量時，先用空氣泵置換瓶內(nèi)空氣，待空氣置換干凈后，用帶有不銹鋼針頭的橡膠塞封口，針頭處連接三通閥。25℃下密閉培養(yǎng)5 h后用注射器抽取35 mL瓶內(nèi)氣體，用安捷倫氣象色譜儀(GC-7890A)自動進樣并測定N2O含量。檢測器為電子捕獲器ECD，計算機程序控制1 mL定量管和十通閥自動進樣，載氣為高純氮。分離柱溫度、進樣口溫度和檢測器溫度分別為60℃、100℃和330℃。采樣結束后用空氣泵置換瓶內(nèi)氣體，以透氣膜封口，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期采樣。

根據(jù)公式F=△m/(W×△t)=ρ×V×△C/(W×△t)計算N2O排放通量。式中：F為N2O排放通量；△t是密閉培養(yǎng)時間；△m和△C分別為△t時間內(nèi)培養(yǎng)瓶中增加或減少的氣體質量和混合比濃度；V和W分別是培養(yǎng)瓶內(nèi)有效空間的體積和土樣重量；ρ為標況下氣體密度。

累積N2O排放量計算方法：用兩次連續(xù)測量的N2O排放速率的均值乘以兩次測量時期間隔的時間，最后累計相加[7-8]。N2O排放系數(shù)的計算公式為：N2O排放系數(shù)(EF，%)=施肥增加的土壤N2O排放總量(N kg/hm2)/ 施氮量(kg/hm2)×100。

硝化抑制劑對N2O排放的減排率計算公式為：硝化抑制劑對N2O減排率(%)=(添加硝化抑制劑處理N2O排放量-單施尿素處理N2O排放量)/單施尿素處理N2O排放量×100。

1.3.2 土壤指標測定方法 土壤pH采用pH計測定(水土比2.5∶1)；銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)含量采用2 mol/L KCl浸提(水土比5∶1)，流動分析儀測定(Auto AnalyzerIII，BRAN+LUEBBE，Germany)；堿解氮采用堿解擴散法；有效磷采用NaHCO3浸提—分光光度計比色法；速效鉀采用醋酸銨浸提—火焰光度計法測定。

1.3.3 土壤分子生物學指標測定 土壤總DNA采用MoBio PowersoilTMDNA試劑盒(San Diego，CA，USA)提取，方法參照試劑盒說明書。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提D N A片段大小，并用NanoDrop核酸蛋白測定儀(ND-1000)測定DNA的濃度及質量[9]。

Real-time PCR檢測：

1)引物 定量PCR的目標基因為總細菌16S rRNA基因；硝化過程相關基因為AOAamoA和AOBamoA，用二者的拷貝數(shù)分別表示AOA和AOB的數(shù)量；反硝化過程相關基因為nirK和nirS。目標基因的引物、出處、序列見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2)反應體系amoA：5 ng DNA模板，上下游引物各100 nM，5 μL 2X SYBR?Premix ExTaqTM(Takara，日本)，雙蒸水補至10 μL。nirK：2.5 ng DNA模板，上下游引物各150 nM，5 μL 2×SYBR?Premix Ex TaqTM(Takara日本)，雙蒸水補至10 μL。16s rRNA基因：2.5 ng DNA模板，上下游引物各150 nmol/L，1 μL of 10×反應緩沖液，0.8 μL dNTPs(10 μmol/L)，0.25 μL 10×SYBR?Premix ExTaqTM(Takara日本)，0.5 U of HSTaq酶，雙蒸水補至10 μL。

3)PCR擴增程序95℃預變性3 min；并在94℃變性30 s，60℃(退火溫度視目標基因而定，見表1)30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72℃修復延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

4)標準曲線制備 分別構建細菌16s rRNA、amoA、nirK基因的質粒標準曲線，標準曲線的范圍在102～108[14]。擴增效率和拷貝數(shù)通過下列公式計算：

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0中單因素方差分析(ANOVA)的Duncan檢驗進行差異顯著性(P＜0.05)檢驗。用Sigmaplot 13.0軟件作圖[15]。

表1 定量PCR所用引物及PCR條件Table 1 Primers and conditions for RT-PCR

2 結果與分析

2.1 硝化抑制劑對土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的影響

與對照相比，施肥處理銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量均顯著增加，并分別在第3天和第16天達到最大值(圖1)。銨態(tài)氮在培養(yǎng)后的第23天左右降低至對照水平。在培養(yǎng)前23天內(nèi)，與單施尿素處理相比，添加硝化抑制劑處理保持了較高的NH4+濃度。說明添加的硝化抑制劑DCD和DMPP均延緩了氨氧化過程，減緩了NH4+向NO3-的轉化。與添加DCD的處理相比，添加DMPP處理的硝態(tài)氮濃度可在更長的培養(yǎng)時間內(nèi)保持最低水平。

2.2 硝化抑制劑對N2O排放通量和總量的影響

研究結果顯示，在尿素施用后，各施肥處理N2O排放迅速增加，在第4天時均達到峰值后快速下降。從圖1可以看出，N2O排放主要集中在施肥后的前兩周內(nèi)。添加DMPP處理排放系數(shù)為0.05%，添加DCD處理為0.18%，添加DMPP顯著低于添加DCD。添加硝化抑制劑DCD和DMPP均顯著減少了N2O排放峰值和累積排放量，其減排率分別達到21.6%和78.3%(圖1，表2)。

2.3 硝化抑制劑對AOB和AOA豐度的影響

圖2顯示，與CK相比，培養(yǎng)3天時，含尿素處理土壤AOB數(shù)量均顯著增加；與單施尿素處理相比，培養(yǎng)3天時尿素+DCD處理土壤的AOB數(shù)量顯著減少32.4%，但在培養(yǎng)30天時的AOB數(shù)量與單施尿素處理相當，培養(yǎng)90天時，AOB數(shù)量顯著高于單施尿素處理。尿素+DMPP處理在培養(yǎng)第3、30和90天時，土壤中的AOB數(shù)量顯著低于尿素+DCD處理。與單施尿素相比，尿素+DMPP處理對AOB數(shù)量的抑制率可達35%～58%(P＜0.05)。土壤AOA對施肥的響應與AOB相反。在整個培養(yǎng)期間，施加尿素的AOA數(shù)量并沒有增加，反而顯著減少。尿素+DMPP處理在培養(yǎng)前期能顯著減少AOAamoA基因拷貝數(shù)，培養(yǎng)后期無顯著抑制作用；而尿素+DCD處理AOA沒有顯著變化。

圖1 添加不同硝化抑制劑土壤N2O排放通量、NH4+-N和NO3--N含量的變化Fig.1 Variation of N2O emission, NH4+-N and NO3--N contents in soils added with different nitrification inhibitors

2.4 硝化抑制劑對nirS和nirK基因豐度的影響

與對照相比，施肥處理能夠顯著增加nirK和nirS基因拷貝數(shù)(圖3)，nirK基因拷貝數(shù)為nirS基因拷貝數(shù)的4.5～11.3倍。與單施尿素處理相比，尿素+DMPP處理在培養(yǎng)第3天和第30天nirS和nirK基因拷貝數(shù)均顯著減少，DMPP在一定程度上影響了反硝化作用；DCD處理對nirS和nirK數(shù)量無顯著抑制。

表2 添加不同抑制劑土壤N2O排放總量和排放系數(shù)Table 2 Total N2O emissions and emission factors in soils added with different nitrification inhibitors

圖2 硝化抑制劑對氨氧化細菌和氨氧化古菌豐度的影響Fig.2 Effect of nitrification inhibitors on abundance of AOB amoA(a)and AOA amoA gene(b)

圖3 添加不同硝化抑制劑土壤中的反硝化基因nirS和nirK基因拷貝數(shù)Fig.3 Abundance of nirS and nirK gene in soils added with different nitrification inhibitors

3 討論

本研究中所有施肥處理的N2O排放均主要發(fā)生在前兩周，且在第4天時達到峰值，與前人[16-17]研究結果一致。尿素添加DCD和DMPP均能較長時間保持高含量的銨態(tài)氮，減緩硝酸鹽的生成，從而實現(xiàn)N2O的減排。這說明硝化抑制劑DCD和DMPP可抑制水稻土壤中NH4+向NO3-的轉化，減緩硝化作用過程，進而減少溫室氣體N2O的排放。盡管DMPP施用量是DCD的四分之一，但其對硝化作用的抑制效果要遠遠好于DCD。這可能是由于DMPP相對于DCD具有降解速度慢[17]、吸附力強等特點[17]，使其在土壤中硝化抑制效果可以保持更長久并且不易與NH4+分離[18]，也可能與不同硝化抑制劑的結構及作用機理有關[19]。

本試驗結果表明，由于尿素水解后形成了氨，為氨氧化細菌提供了可以利用的底物，施用尿素顯著刺激了氨氧化細菌(AOB)的生長[20]，但在培養(yǎng)第90天時，AOB數(shù)量顯著下降，可能是因為培養(yǎng)前期土壤中氨氧化細菌的快速生長消耗除銨外的其他營養(yǎng)物質，抑制了后期氨氧化細菌的繼續(xù)生長。此外，土壤中銨根離子在培養(yǎng)后期的大量減少也可能是造成氨氧化細菌數(shù)量下降的原因之一。與氨氧化細菌相反，氨氧化古菌(AOA)在施用尿素后，其數(shù)量不但沒有增加，反而顯著減少，說明AOB在土壤氨氧化過程中起主要作用。

本試驗中，尿素與硝化抑制劑DCD和DMPP配施顯著抑制了AOB的生長，但未對AOA有顯著影響。Di等[20]研究也發(fā)現(xiàn)，添加DCD能顯著減少土壤中AOB的數(shù)量，而AOA在牧場土壤中的數(shù)量在整個培養(yǎng)期間無顯著變化。Li等[21]通過田間試驗也發(fā)現(xiàn)與單施尿素相比，DMPP混施尿素處理能顯著減少AOB數(shù)量，并且在兩年時間內(nèi)可使稻田AOB數(shù)量減少24.5%～30.9%。以上研究結果均表明，水稻土中的AOB對硝化抑制劑非常敏感，而AOA對硝化抑制劑DCD和DMPP的耐受性要好于AOB，這可能與二者不同的生理特性有關[22-23]，也與硝化抑制劑的作用機理有關。硝化抑制劑主要通過抑制AOB繁殖來減緩硝化作用[20，24]。通過比較硝化抑制劑DCD和DMPP對AOB數(shù)量抑制的程度，可以發(fā)現(xiàn)DMPP抑制AOB生長的時間和程度均明顯好于DCD。這與DMPP減少N2O排放和NO3-濃度的作用以及延緩NH4+氧化的作用均遠遠好于DCD的研究結果相吻合。

NO3-經(jīng)NH4+氧化生成后可通過土壤反硝化過程產(chǎn)生N2O[25]。對于水稻土，生成的較高硝酸鹽和淹水條件使得大量N2O通過土壤反硝化作用排放。反硝化過程的限速步驟主要由含nirK或含nirS基因的反硝化細菌參與完成[26]。本研究中，在所有處理中nirK基因拷貝數(shù)均顯著高于nirS基因拷貝數(shù)，說明含nirK基因的反硝化細菌在反硝化作用中貢獻可能大于含nirS基因的反硝化細菌。其他研究者在農(nóng)田和稻田土壤也發(fā)現(xiàn)了相似的結果[27-29]。添加DMPP在施肥前期(施肥后第3和30天)顯著減少了nirS和nirK基因拷貝數(shù)，后期抑制作用有減緩的趨勢。而DCD對nirS和nirK基因拷貝數(shù)在整個試驗期間無明顯影響。這種差異可能是由于DCD相對于DMPP對硝化過程有較弱的抑制作用，使得NO3-生成較快，大量的NO3-為含nirK或含nirS基因的反硝化細菌提供了底物，進而使得DCD相對于DMPP對反硝化細菌的抑制效果并不明顯[30]。

4 結論

1)硝化抑制劑DCD和DMPP顯著抑制氨氧化細菌數(shù)量，但對氨氧化古菌沒有影響，并且DMPP對氨氧化細菌的抑制效果要好于DCD。

2)施用硝化抑制劑DMPP能顯著減少含nirS和nirK基因的反硝化細菌數(shù)量，從而延緩NH4+氧化，而DCD對其無明顯影響。

3)DMPP減排N2O的效果好于DCD，供試條件下，二者的減排率分別為21.6%和78.3%。