程 勇 劉辰庚 張麗春 趙萍萍 王紅彥 王培昌*

尿中17-酮類固醇(17-ketosteroide，17-KS)是腎上腺皮質(zhì)與睪丸及卵巢某些類固醇激素代謝產(chǎn)物，可反應(yīng)腎上腺皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素及性腺分泌總的情況，對于評價腎上腺分泌雄激素的功能具有一定的價值。多年來，17-KS的臨床檢測方法主要為分離柱色譜法，但操作步驟繁瑣、費(fèi)時且費(fèi)力，不適合大批量的快速檢測，不能滿足檢驗(yàn)專業(yè)快速及準(zhǔn)確的要求[1]。

2017年，原國家食品藥品監(jiān)督管理局(State Food and Drug Administration，SFDA)首次批準(zhǔn)了用于生化分析儀的17-KS檢測方法及試劑盒，基于此，本研究分析評價該方法的檢測性能及其與傳統(tǒng)手工方法檢測結(jié)果的一致性及臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年5-9月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院收治的50例高血壓患者將其納入高血壓組，其中男性25例，女性25例，平均年齡60歲；選取30例嗜鉻細(xì)胞瘤患者將其納入嗜鉻細(xì)胞瘤組，其中男性15例，女性15例，平均年齡59歲；選取30例庫欣綜合癥患者將其納入庫欣綜合征組，其中男性15例，女性15例，平均年齡59歲；另隨機(jī)抽取30名健康受試者作為健康對照組，其中男性15名，女性15名，平均年齡60歲；隨機(jī)選取30名高血壓待確診患者作為待確診組，其中男性15名，女性15名，平均年齡38歲。本研究內(nèi)容已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①高血壓患者滿足《中國高血壓防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②嗜鉻細(xì)胞瘤患者滿足《腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷與治療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；③庫欣綜合征患者滿足《庫欣綜合征治療的臨床實(shí)踐指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；④健康對照組生長發(fā)育正常，心臟、肝臟、腎臟和腦不存在其他疾病，未服用其他神經(jīng)、精神類藥物及其他治療性藥物；⑤待確診患者為有高血壓癥狀，但排除嗜鉻細(xì)胞瘤和庫欣綜合征者。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①心臟、肝臟、腎臟和腦存在其他疾??；②服用其他治療性藥物者。

1.3 儀器與材料

(1)儀器設(shè)備。7600全自動生化分析儀(日本日立公司)，該試劑盒為液體雙試劑，按照試劑盒說明書在日立7600儀器P模塊設(shè)置反應(yīng)條件并操作；722 s型紫外可見分光光度計(上海析譜儀器有限公司)，檢測時儀器處于正常的維護(hù)、保養(yǎng)和檢定狀態(tài)。

(2)試劑盒材料。分離柱色譜法尿17-KS檢測試劑盒(西班牙Bio-System公司)；均相酶免疫法尿17-KS檢測試劑盒(蘇州博源醫(yī)療科技有限公司)。

1.4 檢測方法

(1)樣本采集與處理。5組受試者按照《全國臨床檢驗(yàn)規(guī)程第四版》的要求準(zhǔn)確留取24 h尿液，經(jīng)5 L帶刻度燒杯精確測量尿量，混合均勻用帶帽10 ml離心管留取8 ml尿液，于離心機(jī)上3000 g離心5 min，上清置于新的帶帽離心管2～8 ℃保存，3 d內(nèi)檢測完畢。

(2)手工法。采用分離柱色譜法，試劑盒批號：REF11002、LOT17953，校準(zhǔn)品LOT127XA，校準(zhǔn)品稀釋液LOT126XA，質(zhì)控品LOT142XA，質(zhì)控品稀釋液LOT142XA。由具有中級專業(yè)職稱且長期從事17-KS檢測工作的人員按試劑說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

(3)生化法。均相酶免疫法尿17-KS檢測試劑盒，試劑盒批號：Lot#170327，校準(zhǔn)品Lot#170327，質(zhì)控品Lot#170327。

1.5 觀察及評價指標(biāo)

(1)正確度驗(yàn)證。①分別使用兩種方法檢測第三方定值質(zhì)控品(BIO-RAD LOT63360)3次，計算平均值與相對偏差；②分別使用兩種方法學(xué)試劑檢測兩種試劑盒的配套校準(zhǔn)品(選3個濃度)3次，計算平均值與相對偏差。

(2)精密度驗(yàn)證。①批內(nèi)精密度，選取2個尿液樣本連續(xù)檢測20次，計算批內(nèi)精密度(CV%)；②批間精密度，選取2個尿液標(biāo)本上午測2次，下午測2次，連續(xù)檢測5 d。

(3)線性范圍。①手工法，將尿液標(biāo)本加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)至試劑盒標(biāo)示的線性范圍上限，做比例稀釋，將理論值和實(shí)測值進(jìn)行線性回歸，計算相關(guān)系數(shù)；②生化法，用尿液標(biāo)本將試劑盒中高濃度17-KS質(zhì)控至試劑盒標(biāo)示的線性范圍上限，做比例稀釋，將理論值和實(shí)測值進(jìn)行線性回歸，計算相關(guān)系數(shù)。同時，利用本組數(shù)據(jù)使用線性回歸計算兩種方法的相關(guān)性，使用t檢驗(yàn)明確其有無統(tǒng)計學(xué)差異。

(4)干擾試驗(yàn)。①分別使用膽紅素、血紅素、甘油三酯、血紅蛋白、白蛋白和抗壞血酸進(jìn)行抗干擾試驗(yàn)，在質(zhì)控品中加入一定量的干擾物質(zhì)達(dá)到相應(yīng)濃度；②計算檢測試劑濃度與理論濃度的偏倚(%)。因Bio-System試劑盒未給出抗干擾的指標(biāo)范圍，故使用博源公司試劑盒給出的抗干擾指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。

(5)受試者陽性率。使用以上兩種試劑盒檢測疾病和健康受試者的17-KS，統(tǒng)計其檢測結(jié)果的一致性和陰陽性率等診斷性能指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間數(shù)據(jù)使用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間檢測結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析；同一受試者不同檢驗(yàn)方法的數(shù)據(jù)比較使用配對t檢驗(yàn)；率的比較使用x2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方法正確度驗(yàn)證結(jié)果

使用手工法和生化法檢測BIO-RAD的相對偏差分別為8.43%和4.23%，手工法高于生化法。兩種方法檢測各自配套校準(zhǔn)品的偏差均相對較小，檢測非配套校準(zhǔn)品的偏差相對較大，但偏差均＜15%，見表1。

表1 兩種檢測方法正確度相對偏差驗(yàn)證結(jié)果(%)

表2 兩種檢測方法干擾試驗(yàn)結(jié)果(%)

表3 兩種檢測方法臨床驗(yàn)證結(jié)果(%)

2.2 兩種檢測方法精密度驗(yàn)證結(jié)果

手工法的批內(nèi)精密度為7.44%，生化法的批內(nèi)精密度為3.99%；手工法的批間精密度為13.18%，生化法的批內(nèi)精密度為5.22%；生化法優(yōu)于手工法。

2.3 兩種檢測方法線性范圍和相關(guān)性驗(yàn)證結(jié)果

手工法線性范圍(0～120 mg/L)達(dá)到說明書要求，相關(guān)系數(shù)r=0.967，P＜0.05；生化法線性范圍(0～120 mg/L)達(dá)到說明書要求，相關(guān)系數(shù)r=0.999，P＜0.05，生化法線性范圍相關(guān)系數(shù)優(yōu)于手工法。兩種方法的檢測結(jié)果相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.92，P＞0.05)，具有良好的相關(guān)性。

2.4 兩種檢測方法干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

干擾實(shí)驗(yàn)生化法試劑盒在其試劑盒說明書給定的范圍內(nèi)其檢測性能指標(biāo)良好，在膽紅素≤40 mg/dl、血紅素≤500 mg/dl、甘油三酯≤1000 mg/dl、血紅蛋白≤1000 mg/dl、白蛋白≤1000 mg/dl和抗壞血酸≤10 mmol/L的情況下偏倚≤10%，手工法試劑盒其抗干擾性能低于生化法，見表2。

2.5 兩種檢測方法臨床驗(yàn)證結(jié)果

兩種檢測方法對5組進(jìn)行臨床驗(yàn)證，生化法檢測嗜鉻細(xì)胞瘤陽性率高于手工法，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=4.59，P＜0.05)，參考臨床診斷得知生化法準(zhǔn)確率高于手工法；兩種方法檢測高血壓腎上腺腫瘤、待確診患者和健康對照組陽性率和陰性率一致，見表3。

3 討論

腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌過多鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素，還可分泌過多的性激素(睪酮)，17-KS為睪酮的代謝產(chǎn)物，增高提示腎上腺腫瘤時激素及其代謝產(chǎn)物的改變[2]。分泌過多的皮質(zhì)醇，引起庫欣氏綜合征。過多的睪酮和皮質(zhì)醇引起17-KS的大副增高[3]。17-KS的檢測也可用于腎上腺腫瘤術(shù)后的療效觀察，術(shù)后1個月所有患者血清皮質(zhì)醇、醛固酮、17-OH、17-KS、VMA以及血清兒茶酚胺均正常[4]。故而檢測17-KS，對于上述病病的診斷與治療有一定的參考意義。

由于17-KS屬于小分子代謝物，使用傳統(tǒng)的生化和免疫方法難以對其進(jìn)行有效的檢測，故長期以來，大部分實(shí)驗(yàn)室均使用抽提法或分離柱色譜法進(jìn)行手工檢測。但隨著國家對試劑耗材注冊證制度的不斷嚴(yán)格，使臨床實(shí)驗(yàn)室對17-KS的檢測試劑盒的選擇僅能在有限的幾種進(jìn)口品牌中選擇，但均為手工方法。

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，對于疾病的診斷、治療及監(jiān)測提出越來越高的要求，臨床檢驗(yàn)的領(lǐng)域也有了飛速的進(jìn)步，方法學(xué)不斷推陳出新。以往不可能完成的檢測現(xiàn)在都在不斷被實(shí)現(xiàn)。臨床醫(yī)生對腎上腺相關(guān)疾病的病因及治療可以有多種輔助方法確證，而尿液17-KS作為輔助診斷依據(jù)的一種，導(dǎo)致臨床實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)標(biāo)本量不斷擴(kuò)大，這對于17-KS一類僅能進(jìn)行手工法檢測項(xiàng)目的檢測壓力不斷增加，許多實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)了須有專人從事17-KS等項(xiàng)目手工檢測的情況，不符合臨床實(shí)驗(yàn)室定量檢測項(xiàng)目自動化、標(biāo)準(zhǔn)化和精密化的發(fā)展趨勢[5]。腎上腺皮質(zhì)疾病的診斷和治療中，生化檢驗(yàn)作為近幾年腎上腺皮質(zhì)疾病診斷中的一種新技術(shù)，在臨床上應(yīng)用的越來越廣泛，發(fā)揮的作用也愈發(fā)明顯[6]。在此背景下，可在生化儀檢測17-KS的試劑盒應(yīng)運(yùn)而生。

經(jīng)本研究實(shí)驗(yàn)室的方法學(xué)評價，生化法的17-KS檢測試劑盒其正確度、精密度均優(yōu)于手工法，且其正確度和精密度的實(shí)測值已經(jīng)達(dá)到了常規(guī)化學(xué)中其他小分子項(xiàng)目如肌酐、尿素等的國標(biāo)要求，表明其檢測精度能滿足臨床的診治需求，并對個體內(nèi)變異進(jìn)行有效區(qū)分。尿液的顏色多變，以色譜法為基礎(chǔ)的手工法17-KS檢測較易受色素的影響；但以均相免疫法為基礎(chǔ)的生化法檢測則對尿液的顏色抗干擾能力較強(qiáng)[7]。

本研究實(shí)驗(yàn)表明，在模擬血尿、膽紅素尿、蛋白尿和使用大量水果或維生素人群標(biāo)本的抗干擾試驗(yàn)中，生化法的抗干擾能力優(yōu)于手工法。在疾病診斷異常率方面，兩者具有大體相似的性能；但在臨界值處的檢測結(jié)果方面，由于生化法具有更好的正確度和精密度，故其對這類患者的診斷更有優(yōu)勢。

色譜法雖然是檢測17-KS的較好方法，但目前國內(nèi)尚無經(jīng)SFDA頒發(fā)注冊證的色譜儀法的17-KS檢測系統(tǒng)。在此背景下，我國試劑廠家率先研制出以均相酶免疫為方法學(xué)的17-KS檢測試劑盒，該試劑盒于2017年3月15日獲得SFDA的批準(zhǔn)也使其成為了國內(nèi)首個能進(jìn)行17-KS自動化檢測的試劑盒。均相酶免疫技術(shù)的最大技術(shù)優(yōu)勢是檢測藥物、激素、有機(jī)物等小分子物質(zhì)，17-KS即為其中一種。其技術(shù)核心是將具有生物學(xué)活性的半抗原(即待測小分子)與生物酶經(jīng)交聯(lián)劑結(jié)合成酶標(biāo)記的半抗原，同時暴露半抗原的抗原表位使其保留半抗原的抗原性，暴露酶的活性中心以保持酶的活性。當(dāng)酶標(biāo)記的半抗原與相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合后，由于空間位阻、蛋白質(zhì)相互作用或者共價鍵的形成，使所標(biāo)記的酶與抗體密切接觸，覆蓋或影響酶活性中心的結(jié)構(gòu)使酶全部或部分失活。待測標(biāo)本中的待測小分子也是有活性半抗原，故能與反應(yīng)體系中的生物酶標(biāo)記的半抗原共同爭奪抗體并與之結(jié)合。由于反應(yīng)體系中抗體的量是一定的，如待測樣本中的待測物濃度越高，則其競爭性結(jié)合的抗體量越大，導(dǎo)致與生物酶標(biāo)記半抗原結(jié)合的抗體量減少，生物酶活性受抑制的程度降低，故從酶活力的測定結(jié)果就可推算出標(biāo)本中待測物含量[8]。

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室使用均相酶免疫分析技術(shù)作為方法學(xué)的檢測項(xiàng)目相對有限，對于大部分小分子的檢測，均以化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法和微粒子酶免疫法為主。同時，上述檢測項(xiàng)目多為在配套檢測系統(tǒng)上進(jìn)行，具有較好的溯源性、正確度和特異性。對于本研究所使用的均相酶免疫分析技術(shù)而言，由于其使用了開放系統(tǒng)，可在任意全自動生化儀上進(jìn)行檢測，故對其進(jìn)行方法學(xué)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，以保證檢測結(jié)果的有效性和可靠性就尤為重要。同時，24 h尿液17-KS檢測的生物參考區(qū)間相對其他激素類項(xiàng)目而言更加狹窄，故在生物參考區(qū)間邊緣的樣本檢測的正確性和穩(wěn)定性更值得關(guān)注。但由于均相酶免疫法的技術(shù)核心是抗原抗體反應(yīng)，其要求的pH值環(huán)境和離子條件較色譜法嚴(yán)格，故在一些酸性尿、堿性尿和嚴(yán)重腎臟病患者的尿液中其可能出現(xiàn)不可預(yù)知的檢測偏差，應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)室工作人員和臨床醫(yī)生的重視[9]。

4 結(jié)語

用于生化分析儀的17-KS檢測方法，較傳統(tǒng)的手工法具有更好的檢測性能和更大的臨床應(yīng)用價值，生化儀法及試劑檢測可為臨床提供準(zhǔn)確的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)。