丁春燕 劉青杰 封江彬 田 梅 陸 雪 李 爽 高 玲*

早熟衰老或早衰(premature senescence)是指細(xì)胞在非端粒信號(hào)刺激下發(fā)生增殖能力和生理功能下降，是細(xì)胞在生長(zhǎng)和發(fā)育的過程中，形態(tài)和功能發(fā)生變化，提前出現(xiàn)退行性改變，這種形式的衰老與端?？s短無關(guān)，也與細(xì)胞增殖代數(shù)無關(guān)聯(lián)，屬于病理性衰老。能誘導(dǎo)細(xì)胞早衰的刺激因素包括DNA受損、氧化應(yīng)激和一些致癌基因的表達(dá)變化等。電離輻射誘導(dǎo)癌細(xì)胞早衰的相關(guān)研究結(jié)果表明：電離輻射可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人間充質(zhì)干細(xì)胞等發(fā)生早衰[1-2]。電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞早衰的信號(hào)通路較為復(fù)雜，不同研究者在不同的癌癥上進(jìn)行了初步探討。如Wang等[3]的研究表明，8 Gy的γ射線可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)由p53/p21通路誘導(dǎo)細(xì)胞早衰；Kim等[4]發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞HepG2存在不依賴于p53/p21通路，而是由p16介導(dǎo)的輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰。2013-2014年陸續(xù)有課題報(bào)道，輻射可誘發(fā)肺癌細(xì)胞發(fā)生早熟衰老[5-7]。然而，其研究?jī)H限于揭示早衰現(xiàn)象及檢測(cè)下游早衰相關(guān)分子p53和p16等，而對(duì)其更上游的與放射損傷早期反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待更深入的研究闡述。

STAT3是一種將細(xì)胞外信號(hào)傳遞至細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子，位于羧基端第705位的酪氨酸磷酸化使其激活，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，調(diào)控靶基因的表達(dá)，將受體激發(fā)的短暫的胞漿信號(hào)轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)期的基因表達(dá)的改變，其參與細(xì)胞生長(zhǎng)、惡性轉(zhuǎn)化、凋亡等生理功能的調(diào)控，并在多種腫瘤中的表達(dá)持續(xù)性升高[8]。有研究表明，STAT3是導(dǎo)致衰老的早期和晚期事件所必需的，包括引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)簇早期增加和衰老相關(guān)分泌表型(senescenceassociated secretory phenotype，SASP)的產(chǎn)生，涉及白介素6(interleukin-6，IL-6)-STAT3-IGFBP5信號(hào)通路[9]。

STAT3是目前得到廣泛認(rèn)可的輻射誘導(dǎo)表達(dá)基因，本研究的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 Gy劑量電離輻射可以激活肺腺癌細(xì)胞內(nèi)STAT3，繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[10-11]。通過抑制劑阻斷輻射誘導(dǎo)的STAT3活化，可以有效逆轉(zhuǎn)輻射誘導(dǎo)的A549細(xì)胞侵襲和遷移[12]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量X射線可誘導(dǎo)A549細(xì)胞出現(xiàn)劑量依賴性早衰[13]。目前STAT3介導(dǎo)的抗早衰影響肺腺癌細(xì)胞輻射抗性的機(jī)制目前還不明確。因此，本研究進(jìn)一步探討STAT3在X射線誘導(dǎo)A549細(xì)胞早衰中的作用。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備材料與試劑

(1)直線加速器(瑞典Elekta公司Precise)；Thermo Forma培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermofisher公司)；DT5-2型低速臺(tái)式離心機(jī)(北京時(shí)代北利)。

(2)人肺腺癌A549細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和最低需求(minimum essential medium，MEM)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone；青霉素-鏈霉素溶液、β-半乳糖苷酶細(xì)胞染色試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液和BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒以及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液均購(gòu)自江蘇碧云天；細(xì)胞在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；Lip2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)invitrogen；羅氏磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑，1∶1000稀釋的STAT3(美國(guó)CST)，1∶1000稀釋的p-STAT3抗體(英國(guó)Abcam)，1∶2000稀釋的β-actin抗體、1∶3000稀釋的二抗山羊抗兔抗體和1∶3000稀釋的山羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 細(xì)胞照射

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，火箭軍總醫(yī)院放射治療中心直線加速器(瑞典Elekta公司Precise)照射，源皮距離(source skin distance，SSD)為100 cm，X射線能量為6 MV，劑量率為400 cGy/min，用電離室對(duì)6 MV高能X射線(簡(jiǎn)稱X射線)在水模體內(nèi)進(jìn)行劑量校準(zhǔn)，細(xì)胞用75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，照射時(shí)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)含10 ml的10%FBS的培養(yǎng)液，A549細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，瓶底中心點(diǎn)吸收劑量分別為0 Gy、2 Gy、4 Gy以及8 Gy，照后各劑量均分為對(duì)照組、α-氰基-(3，4-羥基)N-芐苯乙烯胺(AG490)組和雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)組共3組。

1.3 細(xì)胞處理

A549細(xì)胞照射后均分的對(duì)照組、AG490組和RAPA組，每組以105/ml鋪于6孔板中，每孔加入2 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)照組不做處理，AG490組加入終濃度為20 μM/ml的AG490抑制劑，RAPA組加入終濃度為1μM/ml的RAPA抑制劑，于24 h、48 h及72 h進(jìn)行β-半乳糖苷酶細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)并計(jì)數(shù)；4 Gy劑量X射線照射的A549細(xì)胞于24 h、48 h及72 h收取細(xì)胞，同時(shí)將4 Gy照射的3組細(xì)胞，4 Gy組、4 Gy+AG490組加入終濃度為20 μM/ml的AG490抑制劑、4 Gy+RAPA組加入終濃度為1 μM/ml的RAPA抑制劑，對(duì)照組為0 Gy照射，于72 h收取細(xì)胞，全部提取蛋白用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.4 β-半乳糖苷酶細(xì)胞染色檢測(cè)細(xì)胞衰老

將A549細(xì)胞鋪于24孔板中培養(yǎng)1 d，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入250 μl的β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min后，吸除細(xì)胞固定液，PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min。加入250 μl染色工作液，避光用保鮮膜封住24孔板防止蒸發(fā)。37 ℃溫箱孵育過夜后，加入0.5 ml的PBS，普通光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果并計(jì)數(shù)，顯微鏡下(100×)5個(gè)隨機(jī)視野中計(jì)數(shù)陽(yáng)性(細(xì)胞體積一半以上藍(lán)色)和總細(xì)胞的數(shù)目，統(tǒng)計(jì)β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，以106/ml種植于6孔板中，每孔加入2 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，待培養(yǎng)細(xì)胞融合度到70%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟參照Lip2000轉(zhuǎn)染說明書。將空載pcDNA3.0和STAT3過表達(dá)(pcDNA3.0-STAT3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，分別命名為pcDNA3.0和pcDNA3.0-STAT3組，于轉(zhuǎn)染后36 h收取細(xì)胞，用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.6 蛋白質(zhì)印跡

RIPA細(xì)胞裂解液裂解A549細(xì)胞，加入磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑，冰浴振蕩30 min，12000 r/min離心10 min取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。加入5×上樣緩沖液，煮沸10 min后以12000 r/min，離心3 min。取上清加入制備好的10%的分離膠與5%的濃縮膠，調(diào)整各上樣量至50 μg，濃縮膠以80 V電壓，分離膠以120 V的電壓電泳。使用PVDF膜，以18 V電壓半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜120 min。5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，一抗孵育4 ℃搖床過夜。TBST洗膜3次，每次15 min，加入二抗孵育60 min，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，用BIO-RAD公司ChemiDoc多功能成像系統(tǒng)曝光成像，采集圖像數(shù)據(jù)后，以β-actin為內(nèi)參，Image Lab分析軟件分析目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組比較采用獨(dú)立樣本，每個(gè)處理組均與對(duì)照組或0 Gy組比較，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT3參與A549細(xì)胞早衰調(diào)控

為驗(yàn)證STAT3是否參與A549細(xì)胞早衰的調(diào)節(jié)，使用過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-STAT3轉(zhuǎn)染使STAT3活化，利用STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490和雷帕霉素(RAPA)阻斷A549細(xì)胞中的STAT3活化，觀察A549細(xì)胞的早衰變化，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 過表達(dá)和抑制STAT3對(duì)A549細(xì)胞早衰的影響結(jié)果示圖

圖1A中pc DNA-3.0和pc DNA3.0-STAT3組p-STAT3蛋白水平依次為：1、1.413；STAT3蛋白水平依次為：1、0.983。過表達(dá)STAT3后，A549細(xì)胞內(nèi)的磷酸化STAT3(p-STAT3)水平顯著升高。圖1D加入AG490和RAPA后，對(duì)照組、AG490組和RAPA組p-STAT3蛋白水平依次為：1、0.545和0.397；STAT3蛋白水平依次為：1、0.966、1.076。A549細(xì)胞內(nèi)的磷酸化STAT3(p-STAT3)水平顯著降低，表明所用兩種抑制劑均能顯著抑制A549細(xì)胞中的STAT3活化；進(jìn)一步利用β-半乳糖苷酶細(xì)胞染色檢測(cè)細(xì)胞衰老結(jié)果顯示，過表達(dá)STAT3可引起A549細(xì)胞早衰增加(圖1A、B及C所示)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.32，P＜0.05)。STAT3抑制劑AG490和RAPA處理均能顯著抑制A549細(xì)胞早衰(圖1D、E及F所示)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(AG490組t=8.5，RAPA組t=5.5，P＜0.05)，表明STAT3參與A549細(xì)胞早衰調(diào)控過程。

2.2 AG490和RAPA抑制劑對(duì)X射線誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)STAT3激活的抑制

在前期的研究中已經(jīng)證實(shí)，X射線照射可引起A549細(xì)胞中STAT3磷酸化水平升高，在本研究中進(jìn)一步檢測(cè)AG490和RAPA是否能抑制X射線照射誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)STAT3激活，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同處理A549細(xì)胞蛋白表達(dá)電泳圖

圖2A顯示，4 Gy的X射線照射后0 h、24 h、48 h以及72 h p-STAT3蛋白水平依次為1、1.822、1.597和1.287；STAT3蛋白水平依次為：1、1.376、1.92和2.093。圖3B顯示，0 Gy、4 Gy、4 Gy+AG490以及4Gy+RAPA p-STAT3蛋白水平依次為1、1.379、1.230和0.710；STAT3蛋白水平依次為1、1.880、0.986和0.992。A549細(xì)胞內(nèi)p-STAT3水平顯著升高，加入AG490和RAPA后，4 Gy的X射線照射誘導(dǎo)的p-STAT3升高被顯著抑制。

2.3 AG490和RAPA對(duì)抑制劑X射線照射引起的細(xì)胞早衰的抑制

利用β-半乳糖苷酶細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)觀察AG490和RAPA對(duì)X射線誘導(dǎo)的A549細(xì)胞早衰的影響，X射線照射可顯著促進(jìn)A549細(xì)胞早衰，加入AG490和RAPA后，X射線照射誘導(dǎo)的A549細(xì)胞早衰被顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明X射線照射通過激活STAT3信號(hào)通路促進(jìn)A549細(xì)胞早衰。AG490組2 Gy，4 Gy和8 Gy與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.7，t=3.1，t=5.8；P＜0.05)；RAPA組2 Gy、4 Gy和8 Gy與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.2，t=12.8，t=8.4；P＜0.05)，如圖3所示。

圖3 X射線照射引起的A549細(xì)胞早衰示圖

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)STAT3參與A549細(xì)胞早衰調(diào)控，同時(shí)發(fā)現(xiàn)STAT3抑制劑可抑制X射線誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)STAT3激活，進(jìn)而抑制X射線照射引起的細(xì)胞早衰。

Kojima等[9]研究表明，STAT3在人原代成纖維細(xì)胞中參與誘導(dǎo)細(xì)胞早衰，而本研究結(jié)果與此一致。同時(shí)，其他的課題組以及本研究均發(fā)現(xiàn)電離輻射在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，還會(huì)激活肺腺癌細(xì)胞內(nèi)STAT3的表達(dá)[14-15]并促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16]且轉(zhuǎn)移能力的增加依賴于STAT3活性的增加。AG490和RAPA分別是JAK2和JAK-STAT通路的抑制劑，均可以抑制STAT3的表達(dá)。電離輻射可能是通過激活JAK2或JAK-STAT途徑激活STAT3的表達(dá)，從而影響細(xì)胞早衰的發(fā)生。使用AG490和RAPA處理后，電離輻射誘導(dǎo)的STAT3的活性增加和細(xì)胞早衰的發(fā)生均受到抑制，這提示電離輻射誘發(fā)的細(xì)胞早衰部分依賴于STAT3的激活。

已知輻射可誘發(fā)肺癌細(xì)胞發(fā)生早熟衰老[5-7]。但目前的研究?jī)H限于揭示早衰現(xiàn)象及檢測(cè)下游早衰相關(guān)分子p53和p16等，而對(duì)其更上游的與放射損傷早期反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)機(jī)制，以及下游激活早衰蛋白的機(jī)制還有待更深入的研究闡述，這也是下一步的工作重點(diǎn)。