王 靜 杜 欣 馮同富 鄭 嶸 周利敏

湖北省婦幼保健院(武漢，430070)

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的女性惡性腫瘤，是當(dāng)下唯一可早期預(yù)防和早期診斷的惡性腫瘤[1]。宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是宮頸癌前病變的主要疾病狀態(tài)，癌前病變時(shí)及時(shí)阻斷，完全清除病灶，可有效預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，改善患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸[2]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，學(xué)者們逐步發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物作為一種特異性物質(zhì)可對(duì)宮頸癌及其癌前病變的診斷起到重要的作用[3]。P16基因是一種抑癌基因，可直接參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，近年國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的可能機(jī)制是高危型人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV)表達(dá)的E7蛋白與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(p Rb)蛋白及P53結(jié)合降解失活，導(dǎo)致細(xì)胞周期失去抑制，細(xì)胞異常增殖惡化而出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化，從而出現(xiàn)P16過(guò)表達(dá)[4]。OLFM4是新近發(fā)現(xiàn)的抗細(xì)胞凋亡的糖蛋白，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)展轉(zhuǎn)移，準(zhǔn)確反映宮頸上皮細(xì)胞增殖分化情況，區(qū)分正常宮頸組織和CIN[5]。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于P16、OLFM4診斷CIN的報(bào)道較為少見(jiàn)，本研究探討陰道鏡活檢聯(lián)合兩種生物標(biāo)志物檢測(cè)輔助CIN診斷，為宮頸癌的早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供可靠依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2017年4月—2019年4月因?qū)m頸病變于本院婦科門(mén)診就診，行陰道鏡活檢的CIN患者240例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①因接觸性出血或異常陰道出血就診；②有性生活史；③自愿簽署本研究知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并自身免疫性疾??；②近期服用過(guò)免疫抑制劑；③有宮腔手術(shù)史或放化療史；④急性生殖道炎癥。根據(jù)病理診斷結(jié)果分為CINI(98例)、CINⅡ(82例)、CINⅢ(60例)。選取同期60例因子宮良性病變切除的宮頸標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 陰道鏡檢查

于月經(jīng)后3～7d行陰道鏡活檢，檢查前48h禁止性生活、陰道沖洗、局部用藥及婦科檢查，儀器選擇Leica MZ6光電一體數(shù)碼電子陰道鏡，由熟練婦科臨床醫(yī)生操作。先將弱酸性醋酸溶液均勻涂抹于宮頸表面定位宮頸可疑病灶，通過(guò)陰道鏡觀察分析圖像顏色、構(gòu)型、邊界、血管等特征，發(fā)現(xiàn)肉眼難以觀察到的亞臨床病變及早期癌變部位，診斷參照《陰道鏡診斷圖譜》[6]。

1.3 P16、OLFM4檢測(cè)

采用免疫組化法檢測(cè)，SP試劑盒、DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，P16抗體、OLFM4抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，實(shí)驗(yàn)方法及步驟參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。石蠟切片，HE染色，抗原修復(fù)采用高溫高壓修復(fù)方法，PBS沖洗3次(3min/次)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗3次(3min/次)，封閉，滴加一抗，4℃過(guò)夜，室溫下復(fù)溫30min，PBS沖洗3次(5min/次)，滴加二 抗，37℃15min，PBS沖洗3次(3min/次)，DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以已知的陽(yáng)性組織作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果分析

P16陽(yáng)性為細(xì)胞核與胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒，OLFM4陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例分為：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性(－)，5%～25%為弱陽(yáng)性(＋)，25%～50%為陽(yáng)性(＋＋)，＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性(＋＋＋)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以%表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陰道鏡檢查與組織病理診斷

陰道鏡活檢診斷符合率CINI為91.7%、CINⅡ?yàn)?0.2%，CINⅢ為96.7%。見(jiàn)表1。

表1 病理診斷與陰道鏡檢查[例(%)]

2.2 P16在不同病理宮頸組織中的表達(dá)

P16在對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率為26.7%，低于CIN各 組(χ2＝36.216、57.593、69.474，P＜0.05)；在CINI、CINⅡ、CINⅢ中陽(yáng)性表達(dá)率存在差異(χ2＝5.446、17.323、7.031，P＜0.05)，見(jiàn)表2。圖1～4。

表2 P16在不同病理宮頸組織中的表達(dá)(例)

2.3 OLFM4在不同病理宮頸組織中的表達(dá)

OLFM4在對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率為20.0%，低于CIN各 組(χ2＝48.065、71.579、80.000，P＜0.05)；在CINI、CINⅡ、CINⅢ中陽(yáng)性表達(dá)率存在差異(χ2＝5.889、16.481，6.203，P＜0.05)，見(jiàn) 表3。圖5～8。

表3 OLFM4在不同病理宮頸組織中的表達(dá)

圖1：P16在慢性宮頸炎中的表達(dá)；圖2：P16在CINI中的表達(dá)；圖3：P16在CINⅡ中的表達(dá)；圖4：P16在CINⅢ中的表達(dá)；圖5：OLFM4在慢性宮頸炎中的表達(dá)；圖6：OLFM4在CINI中的表達(dá)；圖7：OLFM4在CINⅡ中的表達(dá)；圖8：OLFM4在CINⅢ中的表達(dá)

3 討論

宮頸癌的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展過(guò)程是目前唯一明確的、可預(yù)防其發(fā)生的惡性腫瘤，多數(shù)宮頸癌并非突然發(fā)生的，而是由正常宮頸組織逐漸發(fā)展為病變組織，再發(fā)展為癌組織的過(guò)程。CIN是一種局限于上皮內(nèi)的癌前病變，其進(jìn)展至宮頸浸潤(rùn)癌理論上需要一定時(shí)間，若能在早期及時(shí)采取有效干預(yù)措施，可預(yù)防宮頸癌的發(fā)生[7]。婦科醫(yī)生僅憑肉眼觀察宮頸組織，極易忽略光滑、輕度糜爛及無(wú)特殊癥狀的宮頸，無(wú)法根據(jù)糜爛面積、程度判斷病變程度及CIN級(jí)別，造成漏診，延誤病情[8]。陰道鏡活檢可鑒別肉眼無(wú)法觀察到的宮頸病變，診斷靈敏度高，對(duì)部分炎癥及臨床高度懷疑病變患者具重要積極意義，可降低漏診率[9]。本研究顯示，陰道鏡活檢診斷CIN符合率達(dá)到90%以上，表明陰道鏡活檢可明顯提高CIN病變的診斷率。但陰道鏡活檢無(wú)法取得宮頸管內(nèi)的病變組織，且易受操作者臨床經(jīng)驗(yàn)影響，取材組織量少，鉗夾深度不夠及定位不準(zhǔn)確限制了其對(duì)CIN及早期浸潤(rùn)癌診斷的價(jià)值。為了預(yù)防宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者正在試圖尋找一種高靈敏度、高特異性的診斷方法，聯(lián)合生物標(biāo)記物診斷逐漸被應(yīng)用于宮頸癌的早期篩查[10]。

P16是細(xì)胞周期依賴(lài)酶抑制因子，可阻止細(xì)胞從G1期發(fā)展至S期，反饋調(diào)節(jié)有絲分裂，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增值的作用。Mochizuki等[11]發(fā)現(xiàn)，P16在原發(fā)性腫瘤中表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)。HPV病毒感染是宮頸病變的主要致病因素，有研究發(fā)現(xiàn)P16參與了HPV感染引起的宮頸病變進(jìn)展，CIN中HPV的E6癌蛋白可使p Rb功能失活，喪失其對(duì)P16的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，使P16過(guò)度表達(dá)，無(wú)法調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，進(jìn)一步刺激細(xì)胞不斷增殖，最終導(dǎo)致宮頸病變[12]。國(guó)外已有研究發(fā)現(xiàn)[13]，P16陽(yáng)性表達(dá)率越高，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制功能喪失越多，細(xì)胞生長(zhǎng)和分化程度越高，進(jìn)一步加重CIN病情，導(dǎo)致其向?qū)m頸癌發(fā)展。本研究中，P16在對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率低于CIN各組，在CINI中CINⅢ陽(yáng)性表達(dá)率最高，這可能是因?yàn)镃IN患者宮頸上皮細(xì)胞不典型增生破壞了細(xì)胞正常周期及狀態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快，加重病情進(jìn)展。P16表達(dá)隨CIN病變程度增加而逐漸升高，可將其作為評(píng)價(jià)患者疾病分級(jí)的輔助指標(biāo)。

OLFM4是一種可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的新型抗凋亡蛋白，Jang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，OLFM4可參與凝集素及鈣粘素的相互作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移能力有重要影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[15]，OLFM4高表達(dá)可作用于DNA合成的S期、G2/M期，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；OLFM4也可作用于PI3K/PKB下游，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究中，OLFM4在對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率低于CIN各組，且CINⅢ陽(yáng)性表達(dá)率最高，表明OLFM4可較為準(zhǔn)確地區(qū)分正常宮頸組織和CIN組織，反映宮頸細(xì)胞增殖和分化情況，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，陰道鏡活檢聯(lián)合P16、OLFM4檢測(cè)可對(duì)CIN早期進(jìn)行有效篩查和診斷，及時(shí)提供個(gè)性化診療方案干預(yù)進(jìn)而減少宮頸癌的發(fā)生。