楊金偉 王志強(qiáng) 柴三明 王 琰 張 霖 安錦霞 倪亞莉

甘肅省婦幼保健院(蘭州，730050)

我國將復(fù)發(fā)性流產(chǎn)定義為≥3次妊娠28周之前的胎兒丟失[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，3次以上自然流產(chǎn)者妊娠，流產(chǎn)率會上升至40%[2]。植入前胚胎遺傳學(xué)篩查(PGS)技術(shù)的適應(yīng)證包括反復(fù)自然流產(chǎn)等，利用高通量測序、囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢技術(shù)，有更強(qiáng)的時(shí)間優(yōu)勢，可顯著提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率[3]，有效解決遺傳因素造成的流產(chǎn)問題。本研究分組比較復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者應(yīng)用PGS技術(shù)后的妊娠結(jié)局，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本中心2016年1月—2018年4月復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者95例，其中對照組55例，行常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)；篩查組40例，接受PGS技術(shù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①自然流產(chǎn)≥3次，或2次自然流產(chǎn)且其中至少1次流產(chǎn)物檢查證實(shí)存在病理意義的染色體異常；②夫婦雙方外周血染色體核型正常；③婦科檢查、陰道B超、宮腔腹腔鏡檢查提示無子宮解剖結(jié)構(gòu)異常；④內(nèi)分泌功能檢測正常，無高泌乳素血癥、無甲狀腺功能異常、無糖尿病或其它內(nèi)分泌疾??；⑤ 陰道微生態(tài)檢查正常，TORCH檢查陰性，無支原體和衣原體等感染；⑥生殖8項(xiàng)抗體檢測均陰性，凝血功能無異常；⑦男方精液檢查無異常；⑧無長期吸煙、吸毒、酗酒和射線暴露等生活史。

1.2 方 法

1.2.1 取卵、受精和胚胎培養(yǎng) 通過個(gè)體化促排卵方案進(jìn)行控制性超促排卵，在注射hCG后36h，經(jīng)陰道B超指引下穿刺取卵。篩查組于取卵后培養(yǎng)30min后脫顆粒，觀察卵子成熟情況，成熟卵子在hCG日后38～40h行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)。之后在卵裂胚培養(yǎng)液中洗滌卵子，并將其移入培養(yǎng)皿，放入CO2培養(yǎng)。第1天早晨觀察受精情況，將所有正常受精(2PN來源)的胚胎培養(yǎng)至第3天，進(jìn)行透明帶打孔并轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至第5～6天。對照組于取卵后根據(jù)患者實(shí)際情況進(jìn)行IVF。加精后4h拆除顆粒細(xì)胞，觀察第二極體的出現(xiàn)，未出現(xiàn)的成熟卵，加精后6h再次觀察，仍未出現(xiàn)或第二極體不足成熟卵的50%時(shí)，即行補(bǔ)救ICSI(同篩查組)，放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)胚胎發(fā)育情況和年齡要求，挑選1～3枚形態(tài)發(fā)育較好的胚胎移植入宮腔內(nèi)。

1.2.2 囊胚期胚胎活檢 擬進(jìn)行囊胚期活檢的胚胎于第5或6天采用Gardner的評分方法對囊胚進(jìn)行評定，如形成≥4級的囊胚即行滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢[4]。將活檢后的囊胚移入培養(yǎng)皿對應(yīng)微滴，進(jìn)行玻璃化冷凍保存于液氮中，檢出樣本按預(yù)先標(biāo)記的號碼裝入PCR管檢測。

1.2.3 染色體篩查 應(yīng)用高通量測序技術(shù)：①胚胎細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增；②取全基因組擴(kuò)增后的DNA，經(jīng)過片段化(超聲或酶切等)選擇一定片段大小的DNA分子(如150～250bp)；③通過文庫構(gòu)建流程，在上述DNA分子兩端加上測序用接頭；④上機(jī)測序獲得一定長度的序列(reads)；⑤通過相應(yīng)的軟件對測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，獲得每條染色體的統(tǒng)計(jì)量。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)的原理、胚胎DNA測序數(shù)量的結(jié)果和染色體數(shù)量的相對變化，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)算法進(jìn)行差異區(qū)分，實(shí)現(xiàn)胚胎染色體非整倍體的植入前篩查。

1.3 妊娠結(jié)果的判定

胚胎移植后14～16d，測血絨毛膜促性腺激素(β-h CG)值≥5U/L，30d陰道B超示宮內(nèi)有孕囊和胎心搏動(dòng)，判定為臨床妊娠。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料使用(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

兩組女方年齡、Gn總量、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、抗繆勒氏管激素(AMH)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌(FSH、LH、PRL、E2)、平均獲卵數(shù)和MⅡ卵數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較(±s)

表1 兩組一般資料比較(±s)

項(xiàng) 目 對照組 篩查組女方年齡(歲) 31.4±5.0 29.3±3.5 Gn總 量(U) 2599.1±12.8 2615.8±9.0 BMI(kg/m2) 23.0±2.4 22.4±3.1 AMH(nmol/L) 17.5±2.8 12.9±1.7 b FSH(U/L) 5.7±2.1 6.1±2.6 b LH(U/L) 4.9±2.6 5.3±2.1 bPRL(m U/L) 411.9±44.5 322.7±21.4 bE2(pmol/L) 122.4±10.7 123.2±9.6平均獲卵數(shù)(個(gè)) 11.9±2.3 12.2±2.7 MII卵數(shù)(個(gè)) 10.8±1.7 11.4±1.4

2.2 不同年齡組胚胎染色體篩查結(jié)果比較

篩查組40例共活檢212枚胚胎，經(jīng)過高通量測序檢出115枚整倍體胚胎，整倍體率為54.2%；非整倍體胚胎為97枚，非整倍體率為45.8%?！?0歲、31～35歲、36～40歲和＞40歲患者，非整倍體率分別為39.4%(37/94)、39.3%(33/84)、76.9%(20/26)、87.5%(7/8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝18.631，P＜0.05)?！?0歲、31～35歲患者的非整倍體率均低于36～40歲和＞40歲患者(χ2＝11.523，P＝0.001；χ2＝7.422，P＝0.006；χ2＝11.265，P＝0.001；χ2＝7.380，P＝0.007)。

2.3 非整倍體胚胎染色體異常情況

本研究發(fā)現(xiàn)非整倍體胚胎中24條染色體均可出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為染色體的缺失或重復(fù)。按照染色體編號，對非整倍體胚胎染色體異常情況進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，異常比率為1.4%～15.7%，其中13，22，3，15，16和21號染色體出現(xiàn)異常比率均＞10%。

2.4 兩組臨床結(jié)局比較

篩查組胚胎種植率、臨床妊娠率高于對照組，而早期流產(chǎn)率較對照組低(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組ICSI/IVF結(jié)局比較[(%)例]

3 討論

胚胎非整倍性被認(rèn)為是輔助生殖技術(shù)中種植失敗的最常見原因[5]，超過25%的流產(chǎn)是非整倍體胚胎導(dǎo)致的[6]。本研究使用高通量測序技術(shù)，對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者進(jìn)行囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞全染色體核型分析，非整倍體率為45.8%，與張磊[7]的研究結(jié)果接近。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)通過PGS后種植率與臨床妊娠率增高，而早期流產(chǎn)率降低，說明經(jīng)過PGS技術(shù)篩選后移植的胚胎整倍體率、胚胎的后期發(fā)育潛能及種植潛能，均高于根據(jù)形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇的胚胎移植對照組。因而PGS篩查不僅可以提高患者種植率，同時(shí)還可以減少患者移植次數(shù)，減輕患者因流產(chǎn)帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及心理壓力，這與肖玉紅[8]的研究結(jié)論一致。

Battaglia等[9]研究顯示，女性卵子染色體異常主要與年齡相關(guān)。本研究探討了不同女性年齡胚胎非整倍體率的差異。結(jié)果表明：當(dāng)女性年齡＜35歲時(shí)，其胚胎的非整倍體率明顯較低，隨著年齡的不斷增加，胚胎的非整倍體率也將隨之增高，尤其對于＞40歲的女性，胚胎的非整倍體率達(dá)到87.5%。

本研究還對所有胚胎的染色體異常類型進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中，23條染色體均可出現(xiàn)異常，其中13-三體和22-三體占比最高。說明13號和22號染色體在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的患者的胚胎中最容易發(fā)生異常。

綜上所述，對于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者行植入前胚胎遺傳學(xué)篩查，可提高胚胎種植率，降低早期流產(chǎn)率。但因本研究納入樣本量較小，本研究存在一定的局限，未來仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，探究植入前胚胎遺傳學(xué)篩查技術(shù)在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值，為輔助生殖技術(shù)發(fā)展提供參考。