呂 輝 楊曉霞 韋啟鵬

湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北省襄陽市中心醫(yī)院(441021)

卵巢顆粒細(xì)胞在卵泡生長發(fā)育中起重要作用[1]。顆粒細(xì)胞的分化受多種生長因子與激素影響。顆粒細(xì)胞表面存在多種特異性受體，如卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、表皮生長因子(EGF)、胰島素生長因子(IGFs)受體，可影響顆粒細(xì)胞增殖分化過程[2]。其中FSH可調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞基因表達(dá)過程，從而誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白重排，顆粒細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變[3]。細(xì)胞骨架是維持細(xì)胞形態(tài)的重要支架[4]。其穩(wěn)定性由微管相關(guān)蛋白與微管蛋白共同調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)微管相關(guān)蛋白tau存在于男性精子中，可能參與精子發(fā)育過程[5]。但tau蛋白在卵巢內(nèi)表達(dá)的相關(guān)報道不多。本研究通過觀察tau蛋白在經(jīng)FSH處理后的不同年齡小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平及定位，探究tau蛋白在卵巢顆粒細(xì)胞中的存在及相關(guān)生物學(xué)功能。

1 材料方法

1.1 實驗動物

選擇出生6周成年雌性小鼠6只(成年組)及未成年雌性小鼠6只(未成年組)(湖北省實驗動物研究中心)，兩組小鼠均室溫20℃飼養(yǎng)，體重成年組(25.5±0.2)g(24～28g)，未成年組(26.4±0.2)g(25～27g)，兩組小鼠體重比較無差異(P＞0.05)。

1.2 小鼠顆粒細(xì)胞收集

向兩組小鼠腹腔內(nèi)注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)促卵泡發(fā)育與排卵。48h后處死小鼠，取出雙側(cè)卵巢，用磷酸緩沖液(PBS)沖洗3次后置含有牛血清白蛋白的營養(yǎng)混合物F-12(DMEM/F-12)細(xì)胞培養(yǎng)基(賽默飛世爾中國)，去除卵巢周圍覆蓋的被膜及脂肪，PBS反復(fù)沖洗≥3次。在解剖鏡下針頭扎卵泡40～50次，釋放卵泡中顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞，加入0.05～0.15%透明質(zhì)酸酶與0.025～0.05%膠原酶消化細(xì)胞間質(zhì)，使釋放出的細(xì)胞成為單個細(xì)胞。于5%CO2，37℃恒溫箱中孵育15min，1000r/min離心5min。棄上清液后得到顆粒細(xì)胞，使用DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液重新懸浮沉淀，5%CO2，37℃恒溫箱中培養(yǎng)5min[6]。PBS洗滌3次后1000r/min離心5min。使用臺盼藍(lán)染液檢測細(xì)胞活性，保證用于培養(yǎng)的細(xì)胞存活率＞90%。

1.3 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)

將分離得到兩組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)：使用DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，計數(shù)細(xì)胞密度。置DMEM/F-12培養(yǎng)基5%CO2，37℃恒溫箱中培養(yǎng)。觀察到顆粒細(xì)胞貼培養(yǎng)基壁后，每組取50%細(xì)胞轉(zhuǎn)入含促卵泡生成素(FSH)的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12h作為FSH組，另50%細(xì)胞繼續(xù)于DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h作為非FSH組。

1.4 Tau蛋白在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)

根據(jù)免疫組織化學(xué)技術(shù)是以帶有顯色劑的特異性抗體與抗原結(jié)合的原理為基礎(chǔ)，通過在細(xì)胞中的呈色反應(yīng)對相應(yīng)蛋白進(jìn)行定性、定量觀察[7]。采用免疫組化法檢測卵巢顆粒細(xì)胞中tau蛋白表達(dá)水平：①使用4%甲醛固定顆粒細(xì)胞30min，PBS沖洗10～15min；②3%H2O2浸泡15min后PBS沖洗15min；③滴加山羊血清封閉液，置37℃恒溫箱30min，過濾封閉液；④滴加兔抗Tau多克隆抗體，置4℃冰箱過夜；⑤37℃恒溫箱升溫50min，PBS沖洗15min；⑥滴加生物素標(biāo)記后的羊抗兔Ig G，置37℃恒溫箱30min，PBS沖洗15min；⑦滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素液，37℃孵育30min，PBS沖洗15min。⑧滴加顯色劑，顯微鏡下觀察到切片組織各細(xì)胞呈現(xiàn)不同顏色后停止顯色，蒸餾水洗滌；⑨依次使用不同濃度酒精脫水，70%脫水5min、80%脫水5min、90%脫 水5min、95%脫 水10min，二甲苯中浸泡20min。中性明膠封片，顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞陽性數(shù)量。另普通兔血清代替兔抗tau抗體作為空白陰性對照。細(xì)胞內(nèi)有染色為棕黃色或深棕色的顆粒為陽性。

1.5 tau蛋白在顆粒細(xì)胞中的定位

構(gòu)建pcDNA3-tau，使用亞克隆技術(shù)將構(gòu)建好的pc DNA3-tau轉(zhuǎn)入新載體pm Cherry-C2，插入點選擇多克隆位點。經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，擴(kuò)增pmCherry-C2載體中插入的pcDNA3-tau段基因片段。培養(yǎng)后得到重組質(zhì)粒pm Cherry-tau，即pm-Cherry-tau融合蛋白，然后對其轉(zhuǎn)染：使用Polyfectine轉(zhuǎn)染試劑(百恩維生物公司)，通過瞬時轉(zhuǎn)染法將pmCherry-tau融合蛋白轉(zhuǎn)染到成年組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞樣本上。培養(yǎng)24h后使用熒光顯微鏡(德國徠卡生物)觀察顆粒細(xì)胞中pmCherry-tau融合蛋白及微管定位并采集圖像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化反應(yīng)中總陽性細(xì)胞數(shù)

tau蛋白陽性細(xì)胞數(shù)成年組(45.0±3.7)高于未成年組(31.5±6.0)(t＝6.040，P＜0.001)，圖1。

圖1 免疫組化染色細(xì)胞(400×)

2.2 免疫組化反應(yīng)成年組中FSH組與非FSH組陽性細(xì)胞數(shù)

成年組經(jīng)FSH培養(yǎng)后卵巢顆粒細(xì)胞多為棕黃色，著色數(shù)較多；未FSH組陽性數(shù)(23.1±3.2)少于FSH組(32.1±2.8)(t＝6.716，P＜0.001)，圖2。

圖2 成年組卵巢顆粒細(xì)胞(400×)

2.3 免疫組化反應(yīng)未成年組中FSH組與非FSH組陽性細(xì)胞數(shù)比較

未成年組中經(jīng)FSH培養(yǎng)后卵巢顆粒細(xì)胞呈棕黃色或深棕色為陽性，著色數(shù)較少；非FSH組卵巢顆粒細(xì)胞陽性細(xì)胞較少，F(xiàn)SH組陽性細(xì)胞數(shù)(28.45±3.51)多于非FSH組(20.03±2.23)(t＝6.835，P＜0.001)，圖3。

圖3 未成年組卵巢顆粒細(xì)胞(400×)

2.4 成年組顆粒細(xì)胞中tau蛋白定位

小鼠顆粒細(xì)胞中微管發(fā)出綠色熒光，呈放射狀分布；卵巢顆粒細(xì)胞中tau融合蛋白發(fā)出的綠色熒光聚集于細(xì)胞核周圍，近核膜處最為密集，以核為中心呈放射狀分布，與微管形態(tài)分布相似。見圖4。

圖4 卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)定位(400×)

3 結(jié)論

卵巢顆粒細(xì)胞是卵母細(xì)胞增殖分化過程中必不可少的一類細(xì)胞，可從顆粒細(xì)胞形態(tài)變化判斷卵泡發(fā)育過程[8]。會影響卵母細(xì)胞增殖分化過程，從而影響生育繁衍能力[9]。同時卵泡形成過程又與細(xì)胞骨架改變有關(guān)。細(xì)胞骨架包括微管、微絲及中間纖維[10]。細(xì)胞骨架不僅能維持細(xì)胞形態(tài)、承受外力，還能維持細(xì)胞內(nèi)部各結(jié)構(gòu)的有序排列[11]。此外還參與多種重要生命活動，如細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸、結(jié)合蛋白組成動力系統(tǒng)[12]。微管可于所有哺乳動物細(xì)胞中存在，是細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)主干，具有聚合、解聚的動力學(xué)特性，生理狀態(tài)下細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能都取決于微管的穩(wěn)定性[13]。

微管蛋白是構(gòu)成微管的主要蛋白質(zhì)，微管相關(guān)蛋白是細(xì)胞內(nèi)除微管蛋白外能與微管結(jié)合的另一類蛋白，是維持微管結(jié)構(gòu)及功能的必需成分[14]。微管相關(guān)蛋白可存在于多種細(xì)胞中，具有微管結(jié)合活性，通過調(diào)節(jié)特定氨基酸磷酸化及去磷酸化實現(xiàn)其生物學(xué)功能[15]。微管相關(guān)蛋白主要包括MAP1、MAP2、Tau、MAP4[16]。FSH可通過顆粒細(xì)胞表面受體，影響顆粒細(xì)胞內(nèi)激酶信號途徑，從而誘導(dǎo)微管相關(guān)蛋白MAP2D在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平增強(qiáng)[17]。MAP2D蛋白有促進(jìn)微管形成，增強(qiáng)顆粒細(xì)胞穩(wěn)定性作用，但主要位于樹突及非神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞中，且在卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)于特定時期聚集于高爾基體，并非直接作用于顆粒細(xì)胞內(nèi)的微管結(jié)構(gòu)，因此推測有其它微管相關(guān)蛋白直接對微管起調(diào)節(jié)作用[18]。微管相關(guān)蛋白tau主要存在于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，可結(jié)合多種細(xì)胞分子，在微管等細(xì)胞骨架的形成中發(fā)揮重要作用[19]。具有促進(jìn)微管蛋白形成微管、參與信息轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持細(xì)胞形態(tài)、參與細(xì)胞增殖分裂等作用[20]。并且tau蛋白上具有多個磷酸化位點，可增強(qiáng)其對微管結(jié)構(gòu)的生物學(xué)作用，從而間接影響卵母細(xì)胞增殖分化過程[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)免疫組化染色后成年組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞陽性數(shù)明顯更多，表明微管相關(guān)蛋白tau表達(dá)水平高。其原因可能是由于成年小鼠經(jīng)性成熟后卵母細(xì)胞數(shù)量較多，卵巢顆粒細(xì)胞增多，則微管相關(guān)蛋白tau處于高表達(dá)狀態(tài)。加FSH培養(yǎng)后的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞陽性數(shù)量更高，表明FSH具有促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白tau的表達(dá)作用。分析其原因，可能是因FSH具有促進(jìn)卵泡發(fā)育、調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞骨架排序作用，在卵巢顆粒細(xì)胞中可與微管蛋白起協(xié)同作用，共同維持顆粒細(xì)胞穩(wěn)定及功能。本研究標(biāo)記后的tau融合蛋白在顆粒細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞核，以此為中心呈放射狀排列，且與微管在顆粒細(xì)胞內(nèi)分布形態(tài)吻合。表明通過觀察tau蛋白定位可反映微管在卵巢顆粒細(xì)胞中定位情況。

綜上所述，微管相關(guān)蛋白tau在成年小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中高表達(dá)，且主要聚集于細(xì)胞核，與微管分布形態(tài)相似。即微管相關(guān)蛋白tau在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)后能同時反映微管在顆粒細(xì)胞中形態(tài)變化，從而影響卵母細(xì)胞生長發(fā)育。本研究充分了解卵巢顆粒細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白tau的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位，為后續(xù)探究tau蛋白磷酸化及功能提供數(shù)據(jù)與理論支持。