王丹丹，陶貴周△，黃建華，劉華

目前缺血性心臟病常用的治療方法為藥物和手術(shù)治療（包括介入手術(shù)），均能改善大多數(shù)患者的癥狀和體征。但是對(duì)一些終末期的缺血性心臟病，傳統(tǒng)療法治療效果差，預(yù)后不良［1］。目前，血管新生基因治療是缺血性心臟病治療的熱點(diǎn)探索領(lǐng)域之一［2］。C/ebp delta作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)多個(gè)基因表達(dá)［3］。研究發(fā)現(xiàn)C/ebp delta通過(guò)自分泌調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF-C的信號(hào)通路，影響腫瘤淋巴血管新生［4］，提示其可以作為缺血性心臟病治療的一個(gè)重要的潛在靶點(diǎn)。本研究通過(guò)腺病毒載體介導(dǎo)C/ebp delta基因，觀察其對(duì)缺血性心臟的保護(hù)效果，并探討C/ebp delta對(duì)缺血心臟的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量20～25 g，12周齡，雄性，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶均購(gòu)于美國(guó)invitrogen公司；Polyfectine、JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于深圳百恩維生物科技有限公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒EM101、Trans2K PlusⅡDNA Marker BM121購(gòu)于北京全式金生物公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒D2500購(gòu)于Omega；T4 DNA Ligase M0202L購(gòu)于美國(guó)NEB公司；大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司；ViraBind腺病毒純化試劑盒購(gòu)于美國(guó)Cell Biolabs公司；Anti-C/ebp delta抗體購(gòu)于Cell Signaling公司；DNA引物合成及測(cè)序由美國(guó)invitrogen公司完成。

1.3 pDC316-mCMV-C/ebp delta-EGFP腺病毒載體構(gòu)建 全基因合成C/ebp delta（810 bp，GenBank登錄號(hào)：NM_005195.3）并插入pUC57載體。（1）酶切：載體質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP及模板質(zhì)粒pUC57-C/ebp delta經(jīng)NheⅠ+HindⅢ雙酶切（37℃水浴反應(yīng)2 h），將pDC316-mCMV-EGFP酶切大片段產(chǎn)物和C/ebp delta回收。（2）連接：將回收產(chǎn)物于22℃反應(yīng)2 h。（3）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：將上述產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混勻后，冰浴25 min，42℃ 45 s，冰浴2 min，加入LB培養(yǎng)基37℃1 h，離心，棄部分上清，將剩余液體涂抹于含氨芐西林（Ampicillin）抗性的LB培養(yǎng)皿上，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 pDC316-mCMV-C/ebp delta-EGFP和病毒包裝 鋪種293T細(xì)胞，用轉(zhuǎn)染復(fù)合物（DNA懸液與Polyfectine）轉(zhuǎn)染48 h后收集病毒原液，進(jìn)行PCR鑒定。引物：上游5′-ATGAGCGCCGCGCTCTTCAGCC-3′，下 游 5′-TTACCGGCAGTCTGCTGTCCCGG-3′。并按照逐級(jí)稀釋法計(jì)算出病毒滴度。具體方法如下：（1）在滴度測(cè)定前1 d取48孔板，加入3×104/孔293T細(xì)胞。（2）取96孔板，每孔加入90 μL培養(yǎng)基，然后在第1橫排孔每孔加入10 μL待測(cè)病毒原液，混勻后吸取10 μL混合液至第2橫排孔，如此稀釋至第8橫排孔。（3）吸10 μL病毒混合液加入到相對(duì)應(yīng)的48孔板中。（4）經(jīng)48 h感染，用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞情況。一般情況下，在最高稀釋梯度m的孔數(shù)出N個(gè)帶熒光的細(xì)胞，則病毒滴度為N×10m/mL（m為稀釋梯度）。

1.5 局部注射腺病毒C/ebp delta載體對(duì)心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及C/ebp delta的表達(dá)檢測(cè) 取C57BL/6雄性小鼠，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各5只。秤量小鼠體質(zhì)量，以20 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射戊巴比妥鈉，待其麻醉后脫毛，進(jìn)行呼吸機(jī)插管。開(kāi)胸暴露心臟，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠左心室前壁分別注射腺病毒C/ebp delta載體和腺病毒空載體（1×109OPU溶于20 μL生理鹽水）后縫合關(guān)胸。4 d后將小鼠無(wú)痛苦處死，獲取心臟樣本，行免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡檢測(cè)腺病毒載體介導(dǎo)C/ebp delta在心肌細(xì)胞的表達(dá)情況。

1.6 局部注射腺病毒C/ebp delta載體對(duì)小鼠心臟心功能影響 采用1.5方法獲取腺病毒C/ebpdelta載體，局部注射于小鼠心臟前壁，用8-0聚丙烯滌綸線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（left anterior descending branch，LAD）［5］，左室前壁在結(jié)扎時(shí)瞬間變灰白為成功標(biāo)志。以4-0絲線縫合肋間隙，排氣后用6-0縫線分層關(guān)胸。蘇醒后正常飼養(yǎng)4周后，用小鼠麻醉機(jī)異氟烷面罩麻醉小鼠，氧氣流量為0.2 L/min，異氟烷與氧氣的混合比例為0.2。麻醉生效后平臥位，保持平臺(tái)溫度37℃，在小鼠胸部抹超聲膠，運(yùn)用小鼠超聲探頭（50 Hz）在心臟乳頭肌處取心臟橫截面，運(yùn)用B mode和M mode模式行心臟功能檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括左室短軸縮短分?jǐn)?shù)（Left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室射血分?jǐn)?shù)（Left ventricular ejection fraction，LVEF）等［5］。

1.7 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)血管密度及TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎1周后，無(wú)痛苦處死小鼠，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各5只，收獲心臟，行CD31免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色檢測(cè)。

1.8 免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎1周后，無(wú)痛苦處死小鼠，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各5只，收獲心臟，免疫印跡檢測(cè)C/ebp delta對(duì)心肌梗死后心臟低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）蛋白表達(dá)的影響。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)基因庫(kù)序列，運(yùn)用合成法合成人C/ebp delta基因序列，與p-DC316-mCMV-EGFP進(jìn)行基因重組，經(jīng)雙酶切鑒定，p-DC316-mCMV-C/ebp delta-EGFP構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1A；轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后獲得較強(qiáng)的EGFP表達(dá)，見(jiàn)圖1B；經(jīng)PCR進(jìn)一步證明腺病毒C/ebp delta-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后C/ebp delta有效表達(dá)，見(jiàn)圖1C。

Fig.1 The construction and identification of adenoviral vector圖1 腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

2.2 心肌局部注射腺病毒C/ebp delta-EGFP對(duì)心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及C/ebp delta的表達(dá)檢測(cè) 免疫組化染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠在局部注射部位心肌細(xì)胞顯著表達(dá)C/ebp delta，見(jiàn)圖2A。同時(shí)，免疫印跡結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的C/ebp delta蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組（n=5，t=17.462，P＜0.01），見(jiàn)圖2B、C。

2.3 心肌局部注射Ad C/ebp delta-EGFP對(duì)心肌梗死后心功能的影響 小動(dòng)物超聲結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠顯著改善心肌梗死后的心臟功能指數(shù)LVFS和LVEF（n=5，t分別為6.777、2.841，均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 心肌局部注射Ad C/ebp delta-EGFP對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著減少（n=5，t=7.818，P＜0.01），見(jiàn)圖4。

2.5 心肌局部注射Ad C/ebp delta-EGFP對(duì)心臟血管新生的影響 毛細(xì)血管密度（CD31）免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖5A。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠在心肌梗死交界區(qū)的血管密度顯著增加（n=5，t=7.866，P＜0.01），見(jiàn)圖5B。

2.6 心肌局部注射Ad C/ebp delta-EGFP對(duì)HIF-1、HO-1和VEGF蛋白表達(dá)的影響 免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HIF-1、HO-1和VEGF蛋白的表達(dá)顯著增加（n=5，t分別為13.520、71.650、15.725，均P＜0.01），見(jiàn)圖6。

3 討論

3.1 腺病毒介導(dǎo)的C/ebp delta改善小鼠缺血性心臟的功能 通過(guò)結(jié)扎小鼠心臟冠狀動(dòng)脈前降支制作心肌梗死模型發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)C/ebp delta可以改善心肌梗死后的心臟功能，減小心肌梗死面積。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)C/ebp delta既減少缺血后心肌細(xì)胞的凋亡又可增加心肌梗死區(qū)周圍的血管密度，提示C/ebp delta可能通過(guò)減少心肌凋亡和促進(jìn)血管新生雙重作用來(lái)改善缺血心臟的功能。

3.2 HIF-1對(duì)缺血性心臟的作用 研究表明，HIF-1可以有效影響心肌細(xì)胞的存活。Lee等［6］發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)患者的心肌活檢標(biāo)本中HIF-1在mRNA和蛋白水平表達(dá)增加。暴露于全身性缺氧環(huán)境后，在大鼠心臟中觀察到HIF-1α的廣泛表達(dá)；而結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈后，HIF-1α局部表達(dá)增加，主要發(fā)生在梗死組織的邊界并持續(xù)4周［7］。Kido等［8］采用在心肌中過(guò)表達(dá)HIF-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)這些小鼠在冠狀動(dòng)脈閉塞后4周時(shí)表現(xiàn)出心肌細(xì)胞凋亡的減少和心臟功能的改善。除了心肌保護(hù)作用外，HIF-1還可影響心臟的血管新生［9］。HIF-1α由缺氧激活，靶向引起廣泛的基因表達(dá)，其中包括促血管新生基因VEGF［9］。心肌梗死早期，HIF-1α在心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)［7］。在心肌細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)HIF-1α的小鼠在心肌梗死后表現(xiàn)出心臟功能的改善，此情況與心肌中VEGF表達(dá)增加和血管新生有關(guān)［10］。

Fig.2 The transfection efficiency and expression detection of Ad C/ebp delta-EGF in cardiomyocytes(IHC,×200)圖2 Ad C/ebp delta-EGFP在心肌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)檢測(cè)（免疫組化，×200）

Fig.3 Effects of Ad C/ebp delta-EGFP on cardiac function after myocardial infarction圖3 Ad C/ebp delta-EGFP對(duì)心肌梗死后心功能的影響

Fig.4 Effects of Ad C/ebp delta-EGFP on apoptosis of myocardial cells(TUNEL staining,×200)圖4 Ad C/ebp delta-EGFP對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL染色，×200）

Fig.5 Effects of Ad C/ebp delta-EGFP on cardiac angiogenesis(IHC,×200)圖5 Ad C/ebp delta-EGFP對(duì)心臟血管新生的影響（免疫組化，×200）

3.3 C/ebp delta通過(guò)HIF對(duì)缺血性心臟的保護(hù)作用 C/ebp delta是屬于C/ebp家族的一種轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟、肺、脂肪、小腸等組織上表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖和分化［11］。C/ebp delta一個(gè)重要功能是調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，包括腫瘤髓樣抑制細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體 2（VEGFR2）［3］、成骨細(xì)胞的胰島素樣受體Ⅰ［12］、肝癌細(xì)胞的LC3B和ATG3基因［13］及乳腺癌細(xì)胞的CDC27/APC3基因［14］。研究表明，HIF-1能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的C/ebp delta表達(dá)，反過(guò)來(lái)，C/ebp delta促進(jìn)HIF-1的升高［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血后過(guò)表達(dá)C/ebp delta，HIF-1、HO-1和VEGF蛋白表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明C/ebp delta通過(guò)HIF-1，在改善缺血心臟功能中起重要作用。在心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)C/ebp delta后既減少心肌細(xì)胞的凋亡，又增加心肌的血管新生，提示HIF-1在其中起著重要的橋連作用?？赡艿臋C(jī)制為心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)C/ebp delta后引起HIF-1的升高，HIF-1引起一系列細(xì)胞因子，如HO-1、VEGF等升高，減少心肌缺血后心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生及促進(jìn)心臟的血管新生。而C/ebp delta如何調(diào)節(jié)HIF-1，有待進(jìn)一步研究。

Fig.6 Effects of Ad C/ebp delta-EGFP on HIF-1,HO-1 and VEGF proteins in myocardial cells圖6 Ad C/ebp delta-EGFP對(duì)心肌細(xì)胞中HIF-1、HO-1和VEGF蛋白的影響

綜上所述，在本研究中，腺病毒載體介導(dǎo)的C/ebp delta在心肌局部注射后獲得較高的轉(zhuǎn)染效率及C/ebp delta蛋白表達(dá)。心肌局部注射攜帶C/ebp delta的腺病毒載體可改善心肌梗死后心臟功能，減少心肌細(xì)胞的凋亡，增加心肌梗死交界區(qū)的血管密度。其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)HIF-1，從而激活HIF-1的轉(zhuǎn)錄信號(hào)通路，增加HO-1和VEGF的表達(dá)，促進(jìn)心臟功能的改善。本研究為腺病毒介導(dǎo)C/ebp delta治療缺血性心臟病提供了實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。