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禽流感病毒可以感染家禽、野禽甚至哺乳動(dòng)物并致死，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，亦危害公共衛(wèi)生安全,是重要的人獸共患病病原。目前禽流感病毒有18個(gè)H亞型(H1 -H18)及11個(gè)N亞型(N1-N11)，其中H1-H16亞型的流感病毒均可在水禽中分離到[1]，而H17和H18自蝙蝠中檢出[2]。野禽是禽流感病毒的天然宿主，并可通過(guò)遷徙，造成世界范圍的大流行；豬和水禽是禽流感病毒的混合器，可以同時(shí)感染多種不同亞型的流感病毒，并在其體內(nèi)發(fā)生重組，產(chǎn)生新的亞型；家禽活禽市場(chǎng)是禽流感病毒的重要儲(chǔ)存庫(kù)，大量不同種屬、不同產(chǎn)地來(lái)源的禽類，高密度的集中在一起，加上管理和消毒不到位，造成禽流感病毒的長(zhǎng)期存在及循環(huán)，并可借此途徑感染人。

禽流感病毒分為高致病性(High Pathogenic Avian Influenza Viruses, HPAIV)和低致病性(Low Pathogenic Avian Influenza Viruses，LPAIV)兩大類。高致病性禽流感因其在禽類中傳播速度快、危害大、致死率高，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類動(dòng)物疫病，成為疫病防控的重點(diǎn)。而LPAIV感染家禽后癥狀不明顯，容易被忽視，因此得以長(zhǎng)期、廣泛的分布，周而復(fù)始的循環(huán)及變異使其不斷適應(yīng)當(dāng)下養(yǎng)殖環(huán)境，進(jìn)而演化成為具有耐藥性及跨種屬感染的新型毒株。有些低致病禽流感病毒如H7N9、H6N1、H10N8、H9N2，甚至可以突破宿主屏障感染人并致死[3-6]，存在著極大的安全隱患。因此只有同時(shí)加大對(duì)LPAIV的監(jiān)測(cè)力度，掌握本地區(qū)家禽禽流感病毒的真實(shí)帶毒情況，才能科學(xué)有效的防控疫病。

1 材料與方法

1.1樣品來(lái)源 選取2016年11月至2017年3月采集的廈門主要幾家活禽交易市場(chǎng)的家禽喉、泄殖腔棉拭子及飼料、水等環(huán)境樣品進(jìn)行禽流感的檢測(cè)及分型鑒定。同批次且相同來(lái)源的樣品為1個(gè)群，共采集75群，534份棉拭子，包括雞25群，265份；鴨24群，152份；環(huán)境26群，117份。

1.2樣品的保存與運(yùn)輸 保存液PBS購(gòu)自HyClone，頭孢西丁鈉購(gòu)自致君(深圳)制藥有限公司，甘油(分析純)購(gòu)自廈門綠茵試劑玻儀有限公司。PBS使用前，配置為頭孢西丁鈉濃度為0.2%、甘油濃度20%的工作液，分裝在2 mL的EP管中，用于樣品的保存。樣品采集后立即置于含冰塊的泡沫箱中，4 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)或-70 ℃保存，檢測(cè)過(guò)程中避免樣品的反復(fù)凍融。

1.3檢測(cè)試劑及儀器 HA禽流感病毒通用診斷試劑盒購(gòu)自QIAGEN，H1-H16亞型及N1-N9亞型的分型診斷試劑盒購(gòu)自碩世生物科技有限公司和深圳澳東檢驗(yàn)檢測(cè)科技有限公司，核酸提取試劑(MagMAXTM-97Viral RNA)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific。熒光定量PCR儀(Cobas z 480)購(gòu)自RoCho，全自動(dòng)核酸提取儀購(gòu)自瑞士TECAN。

1.4檢測(cè)及分型鑒定 待檢樣品經(jīng)全自動(dòng)核酸提取儀提取核酸后，用HA禽流感病毒通用診斷試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果處于臨界值的可疑樣品，經(jīng)重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為可疑時(shí)判為陽(yáng)性，用于禽流感病毒檢出率的統(tǒng)計(jì)。從檢出強(qiáng)陽(yáng)性的群中，混合同群的強(qiáng)陽(yáng)性核酸樣品，用亞型分型診斷試劑盒進(jìn)一步進(jìn)行H1-H16及N1-N9的分型鑒定，計(jì)算不同亞型病毒的群檢出率。

2 結(jié) 果

2.1禽流感病毒的檢出率 2016年11月至2017年3月，在本地幾家活禽交易市場(chǎng)共抽檢75個(gè)群534份樣品，檢出禽流感病毒陽(yáng)性的群33群，陽(yáng)性樣品216份，群陽(yáng)性率為44.0%，樣品陽(yáng)性率為40.4%。其中抽檢雞群25群265份樣品，檢出陽(yáng)性的雞群15群，陽(yáng)性樣品111份，雞群陽(yáng)性率為60.0%，樣品陽(yáng)性率為41.9%；抽檢鴨群24群152份樣品，檢出陽(yáng)性的鴨群11群，陽(yáng)性樣品65份，鴨群陽(yáng)性率為45.8%，樣品陽(yáng)性率為42.8%；抽檢環(huán)境群26群117份樣品，檢出陽(yáng)性的環(huán)境群7群，陽(yáng)性樣品40份，環(huán)境群陽(yáng)性率為26.9%，樣品陽(yáng)性率為34.2%，詳見(jiàn)表1。

表1 活禽交易市場(chǎng)禽流感病毒檢出率Tab.1 Detection rate of avian influenza virus in the live poultry market

2.2禽流感病毒亞型鑒定結(jié)果 從14個(gè)檢出強(qiáng)陽(yáng)性的群中，鑒定出6種HA亞型，不同亞型病毒群檢出率由高到低依次為H9(100%,14/14)、H6(35.7%,5/14)、H11(28.6%,4/14)、H12(21.4%,3/14)、H1(14.3%,2/14)、H3(7.1%,1/14)；檢出5種NA亞型，不同亞型病毒群檢出率由高到低依次為N2(92.9%,13/14)、N6(42.9%,6/14)、N3(35.7%,5/14)、N8(28.6%,4/14)、N9(21.4%,3/14)；H9亞型,N2亞型檢出率特別高，詳見(jiàn)表2。

表2 活禽交易市場(chǎng)部分陽(yáng)性樣本HA、NA亞型分型結(jié)果Tab.2 Results of HA and NA subtypes typing of parts of sample in live poultry market

2.3禽流感病毒混合感染情況 交易市場(chǎng)中環(huán)境樣品中可檢出多種亞型的禽流感病毒。雞群的混合感染不明顯，7個(gè)禽流感陽(yáng)性的雞群中，有6個(gè)群體僅檢出H9N2亞型病毒，混合感染率為14.3%(1/7)；而鴨的混合感染情況較為嚴(yán)重，4個(gè)禽流感陽(yáng)性的鴨群中有3個(gè)存在混合感染，混合感染率為75.0%(3/4)，并且均是3種亞型以上的混合感染；3個(gè)禽流感陽(yáng)性的環(huán)境群中均同時(shí)4種亞型以上的病毒。

3 討 論

家禽的禽流感感染有很強(qiáng)的季節(jié)性，以冬季最高，春秋季次之，因此本研究選取2016年11月—2017年3月的時(shí)間段進(jìn)行抽樣檢測(cè)，根據(jù)近幾年來(lái)廈門市禽流感監(jiān)測(cè)結(jié)果，這5個(gè)月中禽流感檢出率最高。選擇活禽交易市場(chǎng)作為研究對(duì)象，是因?yàn)榛钋萁灰资袌?chǎng)是禽流感病毒的重要儲(chǔ)存庫(kù)，大量不同種屬、不同產(chǎn)地來(lái)源的禽類，高密度的集中在一起，加上管理和消毒不到位，易造成禽流感病毒的長(zhǎng)期存在及循環(huán)，分離到的亞型會(huì)更豐富。目前尚未見(jiàn)到廈門市低致病性禽流感病毒亞型分型情況的報(bào)道，該研究彌補(bǔ)了數(shù)據(jù)的空白，為有效的防控提供科學(xué)依據(jù)。

研究亞型分型時(shí)，篩去檢測(cè)結(jié)果中弱陽(yáng)性和臨界值的陽(yáng)性樣品，選擇具有標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線，Ct值小于30的陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，有利于確保分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果提示該時(shí)期廈門市至少存在6種HA亞型和5種NA亞型的低致病性禽流感病毒，HA檢出率由高到低依次為H9、H6、H11、H12、H1、H3；與華東地區(qū)2002-2010年檢出的亞型相比存在較大的差異，華東地區(qū)有8種HA亞型，檢出率由高到低依次為H3、H6、H11、H1、H4、H9、H10、H8，主要流行的亞型有H3、H6、H11、H1、H4幾種，而H9、H10、H8較少檢出[7-9]。兩地亞型情況存在差異，一是廈門市H9亞型檢出率最高，在所有檢測(cè)的禽流感陽(yáng)性禽群及環(huán)境樣品中均檢出H9亞型，而華東地區(qū)H9檢出率不高；二是廈門市未檢測(cè)出H4、H8和H10亞型；三是廈門市在3個(gè)禽群中檢測(cè)到H12亞型，而這種亞型在華東地區(qū)尚未見(jiàn)報(bào)道。廈門市與華東地區(qū)H6亞型的檢出率均高居第二，可見(jiàn)這種亞型廣泛分布在華東和福建地區(qū)，仍是目前主要流行毒株。筆者認(rèn)為亞型檢出率差異大的原因主要有以下4點(diǎn)：一是研究的年份不同，不同亞型毒株有自身的流行規(guī)律，每隔幾年就會(huì)出現(xiàn)一次大流行；二是不同的地域、氣候、溫濕度條件，都會(huì)影響流感病毒的進(jìn)化及流行情況，有些毒株較適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境，就形成了當(dāng)?shù)氐牧餍卸局?；三是不同地區(qū)家禽的種群結(jié)構(gòu)不同，陸禽和水禽的品種、比例存在差異，飼養(yǎng)模式不同，防疫條件不同，免疫壓力不同，交易市場(chǎng)家禽來(lái)源不同等均會(huì)造成毒株之間的差異；四是不同地區(qū)候鳥(niǎo)的遷徙種類和數(shù)量亦存在差異，因此由候鳥(niǎo)傳播給家禽的毒株亦存在差異。

研究發(fā)現(xiàn)，鴨的感染情況復(fù)雜，多以3種以上亞型的混合感染為主，這增加了防疫的難度。水禽被認(rèn)為是禽流感病毒的儲(chǔ)存庫(kù)和傳染源，可以通過(guò)公用水域與野鳥(niǎo)接觸，隱形感染多種亞型病毒而不發(fā)病，為各亞型的基因重組提供了良好的載體，加快表面蛋白的變異，不斷豐富內(nèi)部基因的重配，最終又可以通過(guò)與陸禽的接觸將變異的新型病毒傳播給陸禽，引起新型病毒的流行與爆發(fā)。因此筆者認(rèn)為水禽的防疫是禽流感防控的重點(diǎn)和難點(diǎn)，盡管水禽很少因感染禽流感病毒發(fā)生大規(guī)模的死亡，但因其在禽流感病毒傳播和進(jìn)化中的重要地位，該病的防控絕不能忽視對(duì)水禽的監(jiān)測(cè)，同時(shí)應(yīng)盡量避免野生水禽、家養(yǎng)水禽及其它野鳥(niǎo)與陸禽間的相互接觸。

雞的感染主要以H9N2亞型病毒為主，檢出率位居首位，預(yù)示著未來(lái)防疫的艱巨性。一方面H9N2自身出現(xiàn)毒力增強(qiáng)的趨勢(shì)。H9N2作為弱毒僅造成家禽呼吸道癥狀，通過(guò)進(jìn)化變異成可致死禽類的強(qiáng)毒株，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。另一方面該亞型毒株已突破宿主種間屏障，可感染人發(fā)病。早在1998-1999年香港、廣州地區(qū)就發(fā)生4例人感染H9N2病例[10]，隨后江西、長(zhǎng)沙、成都、云南、四川等地均出現(xiàn)H9N2感染人病例的報(bào)道[11-15]。人群H9N2血清學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)也驗(yàn)證了H9N2可感染人的結(jié)論[16]。不僅如此，H9N2還為1997年香港暴發(fā)的感染人H5N1、2013年國(guó)內(nèi)暴發(fā)的感染人H7N9及2014年感染人H10N8等亞型流感病毒提供內(nèi)部基因[17-19]，說(shuō)明潛在高致病的毒株可以與H9N2進(jìn)行基因整合，并從H9N2的基因中獲得更適合其生存和致病的基因，產(chǎn)生毒力更強(qiáng)，宿主范圍更廣的新型毒株，達(dá)到其進(jìn)化的目的。因此筆者認(rèn)為，在今后的防疫工作中，在兼顧高致病禽流感防控的同時(shí)，應(yīng)加大對(duì)H9N2亞型的監(jiān)控，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況制定H9N2的免疫計(jì)劃，而活禽市場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)管理消毒，并細(xì)化禽類基本信息，以便溯源，防止該亞型的大流行和傳染人事件的發(fā)生。

利益沖突：無(wú)