趙 靜，鄭麗君，張曉東，王連春，萬瓊蓮，王志遠(yuǎn)

（1. 玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；2. 玉溪市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 玉溪 653100；3. 德宏師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 芒市 678400）

【研究意義】三七〔Panax notoginseng（Bruk）F.H.Chen〕又名田七，為五加科人參屬植物，具有散瘀止血、消腫定痛的功效，迄今已有400余年的馴化栽培歷史。由于對(duì)環(huán)境要求的特殊性，目前三七種植90%以上面積集中在云南?。?］，連作障礙的大面積發(fā)生嚴(yán)重制約著三七種植的可持續(xù)發(fā)展。土壤理化性質(zhì)的改變、自毒作用及微生物失衡導(dǎo)致的病害增加是連作障礙發(fā)生的主要原因，其中微生物群落失衡是最主要的因子［2-4］。在三七栽培中，隨著連作年限的延長(zhǎng)，病害發(fā)病率明顯增加［5］。明確三七栽培種土壤理化性質(zhì)、酶活及微生物群落結(jié)構(gòu)的改變是解決三七重茬問題的關(guān)鍵。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的動(dòng)態(tài)變化越來越多被用來評(píng)估微生態(tài)系統(tǒng)的響應(yīng)，在一定程度上具有反映早期生態(tài)系統(tǒng)破壞與恢復(fù)程度的功能［6］。根際土壤微生物群落能夠迅速反映環(huán)境條件的變化，特別是在作物連作障礙形成的初期對(duì)環(huán)境的變化最為敏感。

【前人研究進(jìn)展】董林林等［7］研究了人參根際1、2、3年的真菌組成變化，與森林土相比，人參根際土壤微生物多樣性較高，且隨著種植年限的增加，多樣性增加趨勢(shì)下降。譚勇等［8］基于Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)分析了三七種植前后土壤及種植3年根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)種植三七前后土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)的變化規(guī)律基本一致。

【本研究切入點(diǎn)】目前尚未見三七根際土壤中隨著種植年限的延長(zhǎng)，真菌、細(xì)菌結(jié)構(gòu)群落變化的系統(tǒng)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究將明確三七重茬土壤中土壤養(yǎng)分及酶活性的變化，結(jié)合高通量測(cè)序的技術(shù)，分析種植年限的延長(zhǎng)對(duì)三七根際土壤真菌群落、細(xì)菌群落影響的相關(guān)性，為克服三七連作障礙提供有效的策略。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土樣于2018年采自云南省建水縣三七種植基地。按照五點(diǎn)取樣法采集3年生三七根際土壤，每點(diǎn)采集2株三七的根際土壤混合，周邊未種植三七的土壤（對(duì)照）也按五點(diǎn)取樣法取樣混合。土壤取樣深度為0～30 cm，土樣采集后迅速置于冰盒中儲(chǔ)存、備用。

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤全氮的測(cè)定采用開氏消煮法，土壤全磷的測(cè)定采用碳酸鈉熔融法，土壤全鉀的測(cè)定采用氫氧化鈉熔融法，有機(jī)質(zhì)的測(cè)定采用油浴加熱K2Cr2O7容量法，有效磷的測(cè)定采用碳酸氫鈉法，有效鉀的測(cè)定采用乙酸銨提取法，堿解氮的測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法，土壤pH值的測(cè)定采用pH計(jì)。

1.3 土壤酶活性測(cè)定

土壤脲酶活性采用苯酚鈉比色法測(cè)定，蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定，堿性磷酸酶采用磷酸苯二鈉法測(cè)定，多酚氧化酶采用鄰苯三酚比色法測(cè)定。

1.4 土壤微生物群落分析

采用MOBIO Power-Soil Kit（MOBIO，美國(guó)）提取土壤總DNA，利用通用引物擴(kuò)增真菌NS1-FUNG通用引物、細(xì)菌16SrRNA基因V3-V4通用引物標(biāo)簽序列。序列擴(kuò)增、純化、均一化參照J(rèn)orge等［9］的方法。

采用Miseq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序平臺(tái)獲取土壤真菌宏基因組序列，利用QIIME 軟件進(jìn)行序列分析。數(shù)據(jù)預(yù)處理采用Flash軟件融合雙末端序列，通過barcode區(qū)分樣品序列，去除非靶區(qū)域序列及嵌合體［10］。采用Sliva將序列進(jìn)行物種分類，對(duì)每個(gè)樣本和每個(gè)物種單元分類進(jìn)行序列豐度計(jì)算，構(gòu)建樣本和物種分類單元序列豐度矩陣。

2 結(jié)果與分析

2.1 種植三七對(duì)土壤養(yǎng)分的影響

土壤酶活性是衡量土壤質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)［11］。從表1可以看出，與對(duì)照相比，隨著三七種植年限的延長(zhǎng)，土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、全鉀、速效磷、速效鉀含量均表現(xiàn)出明顯上升的趨勢(shì)，全氮、全磷、堿解氮含量下降。其中全磷、有機(jī)質(zhì)變化最為顯著，全磷含量為對(duì)照土壤的2.7倍，有機(jī)質(zhì)含量為對(duì)照土壤的1.2倍。

2.2 種植三七對(duì)土壤酶活性的影響

土壤養(yǎng)分是衡量土壤質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。由表2可知，三七種植3年后土壤養(yǎng)分變化明顯，除堿性磷酸酶活性降幅不大外，脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶活性均顯著下降，其中土壤脲酶活性、蔗糖酶活性分別降低16%、19.6%，多酚氧化酶活性變化最為顯著，降低30%。

2.3 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理分析

樣品中真菌及細(xì)菌標(biāo)簽測(cè)序的原始數(shù)據(jù)見表3。使用Usearch去除預(yù)處理后序列中的非擴(kuò)增區(qū)域序列，而后對(duì)序列進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤校正，并調(diào)用uchime進(jìn)行鑒定嵌合體；隨后，再將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)代表性序列進(jìn)行blastn比對(duì)，低于閾值的比對(duì)結(jié)果認(rèn)為是靶區(qū)域外序列，剔除該部分序列后獲得目標(biāo)序列（Filtered num）。為了便于分析，本研究將Filtered num聚類為OUT，相似度低于97%的序列劃分為一個(gè)OUT，每個(gè)OUT可視為一個(gè)微生物物種。

2.4 種植三七對(duì)土壤真菌群落組成的影響

三七種植前后土壤在科水平上檢測(cè)分類出占比較高的15類真菌，分別為Tricholomataceae（白蘑科）、Physodermataceae（節(jié)壺菌科）、Helotiaceae（柔膜菌科）、Nectriaceae（從赤殼科）、Pneumocystidaceae（肺孢子菌科）、Trichocomaceae（發(fā)菌科）、Endogonaceae（內(nèi)囊霉科）、Mucoraceae（毛霉菌科）、Didymellaceae（黑星菌科）、Botryosphaeriaceae（葡萄座腔菌科）、Hydnodontaceae（齒菌科）、Amphisphaeriaceae（黑盤孢科）、Herpotrichiellaceae（草本菌科）、Alphamycetaceae（粉螨科）、Filobasidiaceae（絲狀擔(dān)子菌科）。如圖1所示，兩個(gè)土壤樣品在屬水平上檢測(cè)分布的真菌屬為臘傘屬、犁頭霉屬、鐮刀菌屬、咖啡銹菌屬、念珠菌屬、褐核盤菌屬等25個(gè)屬真菌。三七種植前后土壤樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)組成及種群密度具有明顯不同：種植前土壤中主要以Hygrocybe為優(yōu)勢(shì)菌種（55.17%），而種植三七后明顯下降（0.37%）；隨著種植年限的延長(zhǎng)，F(xiàn)usarium（鐮刀菌屬）取代Hygrocybe（潮霉屬）成為優(yōu)勢(shì)菌種，其占比由0.25%上升到8.31%，增加32倍，該屬真菌主要引起三七根腐病。這與Miao等［4］的研究結(jié)果相似，鐮刀屬真菌是種植三七后土壤中分離最多的真菌屬，說明隨著種植年限的延長(zhǎng)，三七根系土壤中鐮刀菌的數(shù)量會(huì)發(fā)生較大幅度的增加。其次，我們還檢測(cè)到犁頭霉屬、駝孢銹菌屬、灰葡萄孢，含量為7.17%、4.85%、3.04%，其中灰葡萄孢可引起三七灰霉病。另外，分析結(jié)果也表明隨著種植年限的延長(zhǎng)，從屬水平上檢測(cè)到的真菌的種類比種植前土壤有所增加，其種群密度也明顯上升（圖1）。另外，本次樣品中共檢測(cè)到5種引起三七常見病害的病原真菌，分別為：Fusarium（鐮刀菌屬）、Botrytis（葡萄孢屬）、Alternaria（鏈格孢屬）、Rhizoctonia（立枯絲核菌屬）、Colletotrichum（炭疽菌屬），其種群密度均高于種植前。

表1 三七種植前后土壤理化性質(zhì)特征Table 1 Soil physico-chemical properties before and after cropping Panax notoginseng

表2 三七種植前后土壤酶活性(mg/g.24h)Table 2 Soil enzyme activities before and after cropping Panax notoginseng

表3 序列與OUT信息Table 3 Sequence and OUT information

2.5 種植三七對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響

圖1 三七種植前后土壤中真菌微生物群落組成結(jié)構(gòu)特征Fig. 1 Microbial composition of the fungus before and after cropping Panax notoginseng

三七種植前后土壤在科水平上檢測(cè)分類出占比較高的15類細(xì)菌，分別為Gemmatimonadaceae（芽單胞菌科）、Methanomassiliicoccaceae（甲烷菌科）、Xanthomonadaceae（黃單胞菌科）、Bradyrhizobiaceae（慢生根瘤菌科）、Comamonadaceae（叢毛單胞菌科）、Thermoanaerobacteraceae（嗜熱厭氧桿菌科）、Rhodocyclaceae（紅環(huán)菌科）、Gaiellaceae（尚無譯名）、Chitinophagaceae（噬幾丁質(zhì)菌科）、Nocardioidaceae（類諾卡氏菌科）、Rhodospirillaceae（紅螺菌科）、Xanthobacteraceae（黃色桿菌科）、Pseudonocardiaceae（假諾卡氏菌科）、Oxalobacteraceae（草酸桿菌科）、Cystobacteraceae（孢囊桿菌科）等。如圖2所示，三七種植前后土壤樣品中主要分布的細(xì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、嗜酸桿菌屬（Aciditerrimonas）、熒光假單胞菌屬（Pseudomonas）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Streptomyces）、紅游動(dòng)菌屬（hodoplanes）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等。通過分析發(fā)現(xiàn)，三七種植前后土壤中的細(xì)菌群落組成與結(jié)構(gòu)有明顯差異，其中紅游動(dòng)菌屬在3年生三七根系土壤中（0.95）明顯低于未種植三七土壤（2.28），比值相差2.4倍，這與譚勇等［8］的研究結(jié)果相似，一些屬如鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）等隨著三七種植年限的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，而一些常報(bào)道的生防菌如假單胞菌（Pseudomonas）、鏈霉菌（Streptomyces）卻隨著三七種植年限的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。

圖2 三七種植前后土壤中細(xì)菌微生物群落組成結(jié)構(gòu)特征Fig. 2 Microbial composition of the bacteria before and after cropping Panax notoginseng

2.6 種植三七對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，根系作為植物與土壤的接觸部分，不僅從土壤中吸收水分和養(yǎng)分，而且通過根分泌的方式向根周圍釋放一些無機(jī)離子和有機(jī)化合物，這些物質(zhì)的積累會(huì)導(dǎo)致土壤微生物群落改變［12-14］。常用的表征微生物α多樣性的指數(shù)有香農(nóng)指數(shù)（Shanon diversity index）、辛普森指數(shù)（Simpson index）等，香農(nóng)指數(shù)多樣性指數(shù)越高說明微生物群落越豐富，辛普森指數(shù)越低說明微生物群落越豐富。對(duì)三七種植前后土壤樣品進(jìn)行微生物α多樣性分析，結(jié)果（表4）表明，種植三七后土壤中真菌及細(xì)菌的Shannon指數(shù)上升，而Simposon指數(shù)下降，說明土壤中微生物的多樣性隨著種植年限的延長(zhǎng)而增加。

表4 三七種植前后土壤微生物α多樣性豐富度Table 4 The αdiversity of the soil microbial organism before and after cropping Panax notoginseng

2.7 種植三七對(duì)土壤物種豐度的影響

物種豐度熱圖（Heatmap）是用顏色變化反映群落分布的豐度信息，可以直觀地將群落分布豐度值用定義的顏色深淺表示。同時(shí)將樣品以及群落分布信息進(jìn)行聚類并重新排布，將聚類后的結(jié)果顯示在熱圖中，從而可以很好地反映各分類水平上群落分布組成異同。如圖3所示，每一列代表一個(gè)樣本，行代表群落結(jié)構(gòu)，顏色塊代表相對(duì)物種豐度值，顏色越紅表示相對(duì)豐度越高，顏色越藍(lán)則相對(duì)豐度越低，其趨勢(shì)為藍(lán)色＜綠色＜黃色＜紅色。由圖3可知，隨著三七種植年限的延長(zhǎng)，土壤中各真菌的物種豐度會(huì)有所增加；而細(xì)菌卻恰恰相反，隨著三七種植年限的延長(zhǎng)，物種豐度則有所下降。

圖3 真菌、細(xì)菌物種豐度熱圖Fig. 3 Hertmap of fungus and bacteria

3 討論

3.1 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響因素

研究表明，土壤真菌群落的豐度與土壤理化指標(biāo)相關(guān)，pH值、有效鉀、土壤總氮均與真菌群落的豐度顯著相關(guān)［15-16］。董林林等［7］研究表明，土壤pH與Dothideomycetes和Alatospora的豐度顯著相關(guān)，有效鉀含量與Dothideomycetes、Alatospora、Mucorales的豐度顯著相關(guān)，土壤總氮含量與Sordariomycetes、Mucorales的豐度顯著相關(guān)。本研究中，三七種植前后土壤理化性質(zhì)也發(fā)生了較大變化，主要為pH值上升，全氮、全磷含量明顯下降，有機(jī)質(zhì)含量明顯升高，堿解氮降低而速效磷和速效鉀含量升高，這可能是引起土壤真菌群落變化的因素之一。

另外，根系分泌物也會(huì)影響土壤真菌群落變化［17-19］。我們?cè)谇捌谘芯恐?，利用GC-MS從三七重茬土壤中共檢測(cè)到29種化感物質(zhì)，其中對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸二異丁酯對(duì)三七病原菌（F.oxysporumSchlecht）的生長(zhǎng)呈現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象，且當(dāng)對(duì)羥基苯甲酸濃度為5 mmol/L時(shí)能促進(jìn)病菌小孢子的產(chǎn)生［20］。本研究中，3年生三七根系土壤中，F(xiàn)usarium成為優(yōu)勢(shì)菌種，百分比含量為8.31%，比種植前增加32倍，這與前期結(jié)果相符。

3.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化與病害的關(guān)系

Xiong等［21］曾報(bào)道香草根際土壤微生物多樣性隨著連作年限的延長(zhǎng)，真菌群落多樣性增加。本研究中，引起三七病害的主要病原菌Fusarium在連作后增加最為明顯，其次Botrytis、Alternaria、Rhizoctonia、Colletotrichum的豐度也有所上升，這也可能是三七連作病害高發(fā)的主要原因。另外，隨著連作年限的延長(zhǎng)，已報(bào)道的具有生防功能的細(xì)菌Pseudomonas、Streptomyces卻隨著三七種植年限的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，根際群落結(jié)構(gòu)失調(diào)，這可能也與病害的發(fā)生有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究采用土壤酶活性檢測(cè)及土壤理化性質(zhì)測(cè)定方法結(jié)合Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)采用16S rDNA、18S rDNA分析技術(shù)對(duì)三七種植前土壤、種植3年根際土壤中的細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，三七種植3年后土壤養(yǎng)分失調(diào)，表現(xiàn)為pH值、全鉀、有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀含量上升，而全氮、全磷、堿解氮含量下降；土壤酶活性呈下降趨勢(shì)，除堿性磷酸酶活性變化不大之外，脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶活性均明顯下降；三七種植前后土壤在科水平上檢測(cè)分類出占比較高的15類真菌、16類細(xì)菌，其中，三七種植前土壤中真菌主要以Hygrocybe為優(yōu)勢(shì)菌種，而3年生三七根系土壤中Fusarium成為優(yōu)勢(shì)菌種，比種植前增加32倍，且引起三七常見病害的Fusarium、Botrytis、Alternaria、Rhizoctonia、Colletotrichum的種群密度均高于種植前；α多樣性分析及物種豐度熱圖表明，隨著三七種植年限的延長(zhǎng)，土壤中各真菌的物種豐度有所增加，而細(xì)菌卻恰恰相反，隨著種植年限的延長(zhǎng)，物種豐度呈下降趨勢(shì)。