華智銳,李小玲

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000)

土壤鹽漬化是指土壤中含鹽量高達(dá)0.3%以上,使作物生長緩慢或不能生長。在干旱地區(qū),區(qū)域鹽漬化問題日益嚴(yán)重,對區(qū)域農(nóng)業(yè)發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[1]。土壤鹽漬化嚴(yán)重影響植物生長,降低藥用植物的產(chǎn)量,因此研究藥用植物的耐鹽性是非常重要的。開發(fā)利用鹽漬化土壤,推廣種植耐鹽高效的經(jīng)濟(jì)作物,將極大地改善當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境,提高經(jīng)濟(jì)效益。在植物耐鹽害方面,學(xué)者們已做了大量的研究,研究結(jié)果表明：低濃度NaCl脅迫有利于植物種子萌發(fā),植物幼苗還可以通過適度的鹽脅迫誘導(dǎo)抗逆性以減輕鹽脅迫引起的傷害；但是隨著NaCl脅迫濃度的增加,植物幼苗耐鹽能力明顯下降[2-3]。

鈣被稱為“植物代謝和發(fā)育的主要調(diào)節(jié)者”,主要存在于葉片或老的器官和組織中,它是一個(gè)相對流動(dòng)的元素。鈣可作為生物膜中磷脂酰膽堿和蛋白質(zhì)羧基之間的橋梁,從而維持質(zhì)膜的完整性，降低細(xì)胞膜在鹽脅迫下的滲透性，增加逆境中脯氨酸的含量。細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的鈣與可溶性鈣調(diào)素(calmodulin, CaM)結(jié)合形成活性Ca2+·CaM復(fù)合物,作為代謝調(diào)控的“第二信使”[4]。鈣可以緩解鹽脅迫,在鹽堿地的治理中具有很大的應(yīng)用潛力,有助于鹽堿地的開發(fā)利用[5]。

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)又稱赤參、紫丹參、紅根等,是唇形科多年生草本植物,在向陽的山坡、草叢、溝邊、路旁或林邊等地均能發(fā)現(xiàn)它,在全國廣泛分布。該植物味苦,性微寒,入心,具有活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛、清熱安神的作用。丹參作為丹參滴丸、丹參片和口服液等藥物的主要成分,能在一定程度上緩解患病人群的病痛[6]。現(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有多種藥理作用,如增加冠狀動(dòng)脈血流、降低心肌興奮性和傳導(dǎo)性、對心肌缺血性損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[7]。近幾年來,由于丹參的藥理作用非常突出,丹參栽培已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn),但由于土地鹽漬化問題越來越突出,嚴(yán)重影響丹參的產(chǎn)量提高與質(zhì)量形成。如何使現(xiàn)有作物正常生長在鹽漬化環(huán)境下并能獲得一定的產(chǎn)量,這是科研工作者們亟須解決的問題。

國內(nèi)外有關(guān)外源鈣在鹽脅迫條件下對植物生理特性影響的研究報(bào)道較多,例如劉麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)外源鈣能顯著提高鹽脅迫下菠菜的形態(tài)發(fā)生和可溶性蛋白質(zhì)含量,從而降低鹽脅迫對菠菜生長的傷害。脯氨酸是一種易在鹽脅迫下積累的氨基酸,脯氨酸的積累有利于植物耐鹽性的提高。但Chen等[9]的研究認(rèn)為外源鈣對鹽脅迫下脯氨酸積累無明顯影響。周雙云等[10]研究了不同濃度CaCl2對鹽脅迫下巴西蕉幼苗生理特性的影響,發(fā)現(xiàn)經(jīng)CaCl2處理后巴西蕉幼苗和根系中的脯氨酸含量隨著鹽脅迫時(shí)間的延長而增加。此外，許多研究[11-14]表明,在鹽脅迫逆境中外源鈣能有效緩解農(nóng)作物所受到的鹽害。迄今有關(guān)施加外源鈣對鹽脅迫下藥用植物丹參的影響研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過噴施不同濃度的外源CaCl2來處理鹽脅迫下的丹參盆栽植株,測定了其相關(guān)生理指標(biāo),探討了能緩解丹參鹽脅迫的最佳Ca2+濃度,以期提高丹參的抗脅迫能力,為解決丹參在鹽脅迫條件下生長受抑、產(chǎn)量降低問題提供理論依據(jù),也為丹參的抗性育種研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試丹參品種為“紫花丹參”,于2018年4月購于商洛市洛南縣藥材種植基地。配制鹽溶液所用NaCl、CaCl2均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 電子天平(FB323)、紫外可見分光光度計(jì)(UV755B)、冷凍離心機(jī)(KH30R-Ⅱ)、電熱恒溫水浴鍋(XMTD-8000)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(101型)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)培養(yǎng) 本試驗(yàn)采用盆栽處理,將所購買的一年生丹參幼苗移栽至直徑50 cm左右的花盆中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),在戶外自然光照、溫度條件下培養(yǎng)1個(gè)月左右,期間定時(shí)澆水和松土以保持土壤濕潤。1個(gè)月后選取生長一致的幼苗用于試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)對照和5個(gè)處理。對照: CK1,蒸餾水對照; CK2,100 mmol/L NaCl。處理: T1,10 mmol/L CaCl2+100 mmol/L NaCl; T2,20 mmol/L CaCl2+100 mmol/L NaCl; T3,30 mmol/L CaCl2+100 mmol/L NaCl; T4,40 mmol/L CaCl2+100 mmol/L NaCl; T5,50 mmol/L CaCl2+100 mmol/L NaCl。

將長勢一致的丹參幼苗移栽至花盆(直徑15 cm)中,每盆栽植3株,每個(gè)處理3個(gè)花盆,共計(jì)21盆,63株。在100 mmol/L NaCl脅迫條件下,采用葉面噴施方法,噴施不同濃度的CaCl2處理盆栽丹參幼苗植株,每株噴施5 mL,每2 d噴施1次, 6 d后采集葉片進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測定。

1.2.3 測定指標(biāo)及方法

1.2.3.1 丙二醛(MDA)含量的測定 MDA含量的測定參照張志良等[15]的方法采用硫代巴比妥酸(TBA)法。稱取不同處理的丹參幼苗葉片1 g,將其剪碎,加入少量石英砂、2 mL 10%三氯乙酸(TCA)和8 mL TCA，充分研磨,將勻漿液于4 ℃以4000 r/min離心10 min；取上清液2 mL,加入2 mL 0.6% TBA液,于沸水浴上煮沸15 min,迅速冷卻,離心；再取上清液分別于532 nm、450 nm波長下測定光密度,根據(jù)公式計(jì)算MDA含量。

1.2.3.2 CAT、POD活性的測定 CAT活性的測定參照李合生[16]的方法采用紫外吸收法。稱取不同處理的丹參幼苗葉片0.5 g,加入2～3 mL在4 ℃下預(yù)冷、pH值為7.0的磷酸緩沖液和少量石英砂，研磨成勻漿后,在4 ℃下以4000 r/min離心15 min；取上清液0.2 mL,加入蒸餾水1.0 mL、0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)1.5 mL,逐管加入0.3 mL 0.1 mol/L的H2O2,在240 nm下測定吸光度,每隔1 min讀數(shù)1次,共測定4 min,根據(jù)公式計(jì)算CAT的活性,以每分鐘內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位(U),計(jì)量單位為U/(g·min)。

POD活性的測定參照李合生[16]的方法采用愈創(chuàng)木酚法。稱取不同處理的丹參幼苗葉片1 g,加適量磷酸緩沖液，研磨至勻漿后于4 ℃下以4000 r/min離心15 min；將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,取3 mL愈創(chuàng)木酚反應(yīng)液,加入1 mL酶液,立即計(jì)時(shí),在470 nm下測定OD值,每隔30 s讀數(shù)1次,共讀6次,根據(jù)公式計(jì)算POD的活性,以每分鐘OD值變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U),計(jì)量單位為U/(g·min)。

1.2.3.3 可溶性糖、蛋白含量的測定 可溶性糖含量的測定參照李合生[16]的方法采用苯酚-硫酸法。稱取不同處理的丹參幼苗葉片0.3 g,剪碎混勻,加入5～10 mL蒸餾水,在沸水中提取30 min，提取2次；將提取液過濾入25 mL容量瓶中,定容至刻度；吸0.5 mL樣品液于試管中,加入1 mL 9%苯酚溶液,以5～20 s加入5 mL濃硫酸,搖勻,在485 nm波長下比色測定吸光度,以蔗糖為標(biāo)準(zhǔn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算糖的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.007X+0.142,R2=0.9991。

可溶性蛋白含量的測定參照李合生[16]的方法采用考馬斯亮藍(lán)法。稱取不同處理的丹參幼苗葉片0.3 g,放入研缽中,添加少量石英砂和蒸餾水，研磨成勻漿后,轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶,定容至10 mL；取2～3 mL勻漿液于10 mL離心管中,于4 ℃下以5000 r/min離心10 min；吸取1 mL蛋白質(zhì)提取液,加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5 mL,充分混合,2 min后在595 nm下比色測定吸光度,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.0023X+0.0751,R2=0.992。

1.2.3.4 葉綠素含量的測定 參照趙世杰等[17]的方法采用丙酮-碳酸鈣法。稱取不同處理的丹參幼苗葉片0.5 g,放入研缽中,加純丙酮5 mL、少許碳酸鈣和石英砂,研磨成勻漿,再加80%丙酮5 mL,將勻漿轉(zhuǎn)入離心管,離心后棄沉淀；將上清液用80%丙酮定容至20 mL,取提取液1 mL,加80%丙酮4 mL稀釋后移入比色杯中,以80%丙酮為對照,分別測定663 nm、645 nm處的OD值,根據(jù)公式計(jì)算葉綠素的含量。

1.2.3.5 脯氨酸含量的測定 Pro含量的測定參照朱廣聯(lián)等[18]的方法采用茚三酮比色法。稱取不同處理的丹參幼苗葉片0.5 g,分別置于大管中,然后向各管分別加入5 mL 3%的磺基水楊酸溶液,在沸水浴中提取10 min(提取過程中要經(jīng)常搖動(dòng)),冷卻后過濾于干凈的試管中,濾液即為脯氨酸的提取液；吸取2 mL提取液于另一干凈的帶玻塞試管中,加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮試劑,在沸水浴中加熱30 min,溶液即呈紅色；冷卻后加入4 mL甲苯,搖蕩30 s,靜置片刻,取上層液至10 mL離心管中,于4 ℃以3000 r/min離心5 min；用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯為空白對照,在分光光度計(jì)上520 nm波長處比色,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中脯氨酸含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.116X+0.003，R2=0.995。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對所有處理的葉片樣品重復(fù)測定3次,結(jié)果為3次測定值的平均值。采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖,采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片丙二醛含量的影響

在逆境中,膜脂過氧化發(fā)生在植物細(xì)胞的細(xì)胞膜中,MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物,因此MDA含量經(jīng)常被用來指示植物對不利條件的反應(yīng)強(qiáng)度。如圖1所示,在單鹽處理下(CK2),丹參幼苗的MDA含量顯著提高,表明丹參幼苗的細(xì)胞受到了氧化脅迫毒害,細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和功能穩(wěn)定性遭到破壞。在鹽脅迫處理下,隨著CaCl2濃度的增加,丹參葉片中的MDA含量整體呈先降后升的趨勢,在T3時(shí)達(dá)到最低水平,但與對照CK1相比上升36.5%，有顯著性差異(P<0.05)；與對照CK2相比下降36.4%。表明鹽脅迫會抑制丹參植株的生長,而施加外源鈣能有效緩解鹽脅迫的毒害,并且以施加30 mmol/L外源鈣處理的效果最佳。

2.2 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片CAT、POD活性的影響

如圖2所示,隨著外源鈣濃度的增大,CAT(過氧化氫酶)的活性先升高后降低,趨勢明顯。各處理之間CAT活性差異顯著,在單鹽處理下(CK2時(shí)),與對照組CK1相比,CAT活性增加了42%。CAT活性在T3時(shí)達(dá)到峰值,與兩個(gè)對照組相比分別增加了134%和65%。

數(shù)據(jù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)。不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

圖1外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片丙二醛含量的影響

POD活性的變化趨勢(如圖3)與CAT的相似,但CK2的POD活性與T1相比差異不顯著(P>0.05),T2～T5的POD活性與CK2相比均顯著增加,且在T3時(shí)達(dá)到最大值,與CK1、CK2對照組相比,分別增加了187%、130%。當(dāng)外源鈣濃度增加到一定程度(T4～T5時(shí))POD活性有所下降,但仍高于CK2。

由以上結(jié)果可知,用不同濃度的外源鈣處理丹參幼苗能明顯提高幼苗葉片中CAT、POD的活性。

圖2 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片CAT活性的影響

圖3 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片POD活性的影響

2.3 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片可溶性糖、蛋白含量的影響

由圖4可知：CK2與CK1相比,可溶性糖含量顯著增加；隨著CaCl2濃度的增加,丹參幼苗葉片可溶性糖含量呈先升后降的趨勢,且在T3時(shí)可溶性糖含量最大,比CK1、 CK2兩組對照分別增加了163%、98%；當(dāng)CaCl2濃度增加到一定程度(處理T4～T5下)時(shí)，可溶性糖含量有所下降,但仍然顯著高于CK1、 CK2的。因此，在鹽脅迫下,植物可通過增加可溶性糖含量來維持細(xì)胞通透性平衡和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。施用外源鈣后,丹參鹽害明顯得到了緩解。

圖4 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片可溶性糖含量的影響

如圖5所示,同樣作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),丹參幼苗葉片中的可溶性蛋白含量的變化趨勢與可溶性糖含量總體相似,但與可溶性糖含量不同的是,在較低的CaCl2濃度處理T1下,丹參的可溶性蛋白含量顯著高于兩個(gè)對照組的(P<0.05),且CK2與CK1相比,可溶性蛋白含量增加了87%；在T3時(shí)可溶性蛋白含量最高,比CK1、CK2兩組對照分別增加了240%、82%。說明在鹽脅迫下一定濃度的外源鈣處理能顯著提高可溶性蛋白的積累量,從而抵抗逆境脅迫。

圖5 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響

2.4 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片葉綠素含量的影響

植物葉片葉綠素含量不僅與植物的光合作用密切相關(guān),而且是衡量植物耐鹽性的主要生理指標(biāo)之一。由圖6可知：CK2與CK1相比較,丹參幼苗葉片的葉綠素含量顯著降低,下降了65%；經(jīng)不同濃度的CaCl2處理后,葉綠素含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢,CK2與T1相比無顯著差異,但與其他處理相比差異顯著,T2、T3、T4、T5處理分別較CK2增加了144%、164%、159%、128%；在T3時(shí)葉綠素含量增加到最大,但仍低于CK1。本試驗(yàn)結(jié)果表明,鹽脅迫能明顯降解葉綠素,外源鈣能有效緩解鹽脅迫對丹參幼苗葉綠素含量的影響,施用30 mmol/L CaCl2減輕了鹽害,處理效果最佳。

圖6 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片葉綠素含量的影響

2.5 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸(Pro)在植物抗鹽脅迫過程中扮演著重要的角色,在鹽漬環(huán)境中,脯氨酸參與滲透調(diào)節(jié),維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性,避免細(xì)胞蛋白質(zhì)等有機(jī)物降解,以提高植物適應(yīng)鹽漬環(huán)境的能力。如圖7所示,與T1相比,在鹽脅迫處理下,丹參幼苗葉片脯氨酸含量顯著增加,施加外源鈣以后脯氨酸含量呈先升后降的趨勢,在T3時(shí)達(dá)到最大,與CK1、CK2相比分別增加了168%、75%。

圖7 外源鈣對鹽脅迫下丹參幼苗葉片脯氨酸含量的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

細(xì)胞膜在維持植物細(xì)胞的微環(huán)境和正常代謝中起著重要的作用。在鹽脅迫條件下,活性氧在植物細(xì)胞中積累,加劇膜脂過氧化,破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)。膜脂過氧化可產(chǎn)生大量的MDA,能參與細(xì)胞各種反應(yīng),MDA含量高低能夠反映植株受損程度的大小。從本試驗(yàn)中可以得出,在鹽脅迫下植物葉片中MDA的含量顯著增加,說明鹽分對丹參幼苗的生長產(chǎn)生了抑制作用,這與楊立飛等[19]的研究結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中,施加外源鈣以后,MDA含量與鹽處理相比,其含量顯著降低,外源鈣可以減緩鹽脅迫下細(xì)胞膜膜脂過氧化,減緩過氧化產(chǎn)物MDA的合成過程,即降低細(xì)胞中MDA的含量,維持細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)。這與朱利君等[20]在研究外源氯化鈣對大蒜幼苗鹽脅迫傷害的緩解作用中所得出的結(jié)論一致。本研究結(jié)果表明,葉面噴施30 mmol/L CaCl2能明顯緩解鹽脅迫的傷害。

植物中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶是植物體內(nèi)有效的活性氧清除系統(tǒng),抗氧化酶協(xié)調(diào)一致的共同作用,能有效去除植物受脅迫時(shí)產(chǎn)生的活性氧和過氧化產(chǎn)物。CAT和POD均能去除植物中產(chǎn)生的過量H2O2,具有穩(wěn)定、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的功能。李百偉等[21]認(rèn)為,外源鈣處理能提高CAT和POD的活性,有效清除鹽脅迫產(chǎn)生的活性氧,減輕甘薯幼苗的膜損害。本試驗(yàn)結(jié)果表明,30 mmol/L CaCl2(T3處理)能顯著提高鹽脅迫下丹參幼苗CAT和POD活性,并保持較高水平。

鹽漬土中Na+、Cl-等離子含量較多,使得土壤與植物根細(xì)胞之間形成滲透差,從而引起滲透脅迫,造成植物生長受抑制、作物產(chǎn)量下降[22]。為了降低鹽害造成的滲透脅迫,植物細(xì)胞會積累滲透性溶質(zhì),特別是可溶性蛋白、可溶性糖、Pro,通常認(rèn)為它們在緩解植物鹽害方面具有關(guān)鍵作用,這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)通過參與細(xì)胞滲透調(diào)節(jié),維持細(xì)胞水勢,避免細(xì)胞脫水,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞組織間溶液的運(yùn)輸、積累和分離,對各種酶的保護(hù)也具有一定的作用[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn),丹參幼苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量呈先上升后下降的趨勢,在T3時(shí)達(dá)到最大值,但在T4～T5時(shí)均呈現(xiàn)下降的趨勢。劉新星等[24]的研究表明,施加外源鈣會顯著增加鹽脅迫下豌豆幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量,而CaCl2濃度與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量并不是正相關(guān)關(guān)系。鹽脅迫會損害植物的細(xì)胞膜,降低植物正常生長所需的鈣元素,因此,施加適量的外源鈣有利于作物抵抗鹽傷害,但過量的Ca2+會導(dǎo)致植物受到離子脅迫。

通常,當(dāng)植物受到鹽脅迫或其它脅迫時(shí),葉綠體中的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)將被破壞。王淑智等[25]研究表明,NaCl降低了光能俘獲和電子轉(zhuǎn)移的量子產(chǎn)率,并影響小球藻中PSⅡ的活性,從而影響植物的光合特性。在本試驗(yàn)中,在單鹽處理下,丹參幼苗葉片中的葉綠素含量顯著降低,而施加外源鈣以后能有效提高鹽脅迫下丹參幼苗葉片中的葉綠素含量,從而增強(qiáng)植物的光合作用,表明外源鈣有助于維持葉綠體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

3.2 結(jié)論

鹽脅迫能抑制丹參幼苗的生長,在外源Ca2+濃度為30 mmol/L(T3處理)時(shí),丹參幼苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白、Pro含量升高,MDA含量降低,葉綠素含量增加,POD、CAT等抗氧化酶活性增強(qiáng),表明施加一定濃度的CaCl2能有效緩解鹽脅迫對丹參幼苗生長發(fā)育的抑制作用,增強(qiáng)丹參的耐鹽性。