周金林，鄧述愷，張仕國

(1巴中市中心醫(yī)院，四川巴中 636000；2西南醫(yī)科大學附院第一醫(yī)院)

肺癌是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤，起源于支氣管黏膜或腺體。全球肺癌的發(fā)病率和病死率均呈上升態(tài)勢，而在我國尤其明顯；目前，我國肺癌的發(fā)病率及病死率已居所有惡性腫瘤之首，其中男性發(fā)病率和病死率居第一位，女性發(fā)病率居第二位(低于乳腺癌)，而病死率居第一位[1]。肺癌分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC大約占肺癌的85%，通過傳統(tǒng)的治療手段，肺癌患者的5年生存率也只有15%左右，使用新的化療藥物和重組人血管內(nèi)皮抑制素以及分子靶向藥物治療后，患者中位生存時間有一定延長，不過晚期肺癌患者的生存率仍然沒有大幅度提高[2]。近年來，醫(yī)學分子生物學和基因檢測技術得到了很大的發(fā)展，肺癌的免疫治療已逐漸成為肺癌治療領域研究的熱點，目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)了PD1、PD-L1等免疫檢測點抑制劑，臨床試驗表明免疫治療可以使NSCLC的病死率得到一定程度的改善。新近研究[3]發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中CRT的表達較正常肺組織明顯升高，并且與肺癌的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤免疫關系密切。BAP31在結直腸癌、宮頸癌及惡性黑色素瘤中明顯升高，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有一定關系，并且與CRT關系密切；二者均有可能成為NSCLC診斷和治療的新靶點，以及預測預后的重要指標。本研究通過免疫組化法檢測NSCLC組織、正常肺組織、癌旁組織中CRT與BAP31的表達，分析其表達的差異性，探索NSCLC組織中CRT和BAP31的表達與患者年齡、性別、吸煙、病理分型、淋巴結轉移及臨床分期的關系，并且研究CRT與BAP31在NSCLC組織的表達水平有無相關性，為進一步尋找新的NSCLC生物標記物以及免疫檢測和治療靶點提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1～12月西南醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院收治的NSCLC患者60例(腫瘤組)，男42例，女18例；年齡35～76(57.3±9.6)歲，其中≥60歲25例，<60歲35例。納入標準：①所選病例均經(jīng)病理學診斷確診為NSCLC患者；②具備完整的臨床診斷和治療資料；③排除其他肺部疾病以及嚴重的心、肝、腎和代謝性疾病，取得待測標本前均未進行放療、化療、分子靶向治療及其他針對惡性腫瘤的治療。依據(jù)WHO肺癌的組織病理學分類方法，腺癌30例，鱗癌30例；依據(jù)2014年NSCLC美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(NCCN)指南，其中將既往有吸煙史且吸煙指數(shù)(每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))≥400支年者列為肺癌的高危人群，以此標準將吸煙指數(shù)≥400支年者的重度吸煙患者歸入吸煙者(28例)，將吸煙指數(shù)<400支年者的輕中度吸煙患者、不吸煙者以及被動吸煙者歸入非吸煙者(32例)；有淋巴結轉移26例，無淋巴結轉移34例；按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2015年第八版肺癌分期標準，Ⅰ+Ⅱ期組39例，Ⅲ+Ⅳ期組21例。手術切取NSCLC組織60例份、癌旁組織(至少距腫瘤邊緣5 cm以上)30例份(癌旁組)。

1.2 組織中CRT、BAP31檢測方法 切取NSCLC組織、正常肺組織以及癌旁組織蠟塊，每個標本切片3張，然后進行烤片，其中2張用于免疫組化，一張用于HE染色。HE染色常規(guī)進行，光鏡下觀察染色結果，然后與免疫組化結果做對照。免疫組化染色經(jīng)過脫蠟、脫苯后分別向每張切片滴加約50 μL的3%H2O2浸泡10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后用PBS液沖洗兩次，隨后將切片浸入盛有檸檬酸緩沖液(pH 6.0)的高溫容器中，微波爐加熱直至沸騰后停止加熱，然后自然冷卻至室溫后取出玻片，蒸餾水沖洗2次，每次2 min，PBS液沖洗3次，每次5 min，厚滴加一抗：每張切片滴加正常山羊血清工作液進行封閉，室溫孵育30 min，然后滴加1∶100的CRT和BAP31一抗，然后進行室溫孵育3 h，PBS液浸洗3次，每次3～5 min；滴加二抗，每張切片滴加50 μL試劑盒中的免疫組化試劑，放入37 ℃的孵育箱中孵育30 min；PBS液沖洗切片，每次5 min，反復沖洗2次；然后進行DAB顯色、分化、脫水、封片，隨后在光學顯微鏡下觀察染色強度及染色細胞數(shù)。染色結果的判斷與分級：結果的判斷是根據(jù)切片的染色強弱程度以及陽性表達的腫瘤細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)百分比進行綜合評估，根據(jù)文獻報道[3]，CRT主要定位于細胞質和細胞膜，其陽性表達的結果是腫瘤細胞胞質或胞膜中出現(xiàn)棕色或者褐色顆粒，在高倍顯微鏡(×400)下觀察切片的染色情況，隨機取10個視野的均值，對腫瘤細胞的陽性表達細胞百分比和染色強度分別進行評分，評分規(guī)則如下：(1)對組織切片中著色的陽性腫瘤細胞數(shù)與腫瘤細胞總數(shù)的比例進行評估，<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；(2)根據(jù)胞質的染色強度進行評分：未見顯色的評為0分，顯色為淺棕色的評為1分，顯色為褐色的評為2分，顯色為黑褐色的評為3分(染色深淺均與背景著色相對比)；(3)定義上述兩項分數(shù)相乘的結果為N，N≤1分評為陰性(-)，16分為強陽性(+++)。在本次實驗研究中，N≥2分按陽性表達計算。BAP31陽性表達的結果是腫瘤細胞胞質中出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒，在高倍顯微鏡(×400)下觀察切片的染色情況，隨機取10個視野的均值，根據(jù)參考文獻[4,5]，參考腫瘤細胞陽性表達數(shù)和染色深淺做綜合評分，即免疫反應評分(IRS)=染色強度(SI)×陽性細胞數(shù)百分比(PP)。未見顯色的為0分，顯色為淺黃色的為1分，顯色為棕黃色的為2分，顯色為棕褐色的為3分(染色深淺與背景著色相對比)。腫瘤細胞陽性表達數(shù)占總腫瘤細胞數(shù)的比例<1%定義為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。IRS<1分定義為陰性表達，IRS 1～12分定義為陽性表達，其中1～6分為弱陽性(+)，7～10分為中等陽性(++)，>10分為強陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗,相關性分析采用Spearman等級相關分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組CRT、BAP31陽性率比較 腫瘤組、癌旁組CRT陽性率分別為88.33%、13.33%，BAP31陽性率分別為83.33%、6.67%，兩組比較，P均<0.05。

2.2 CRT、BAP31陽性表達與NSCLC臨床病理參數(shù)的關系 結果見表1。由表1可知，CRT陽性表達與NSCLC淋巴結轉移、臨床分期相關(P均<0.05)。

表1 CRT、BAP31陽性表達與NSCLC臨床病理參數(shù)的關系

2.3 腫瘤組CRT與BAP31表達的相關性 腫瘤組CRT與BAP31表達無相關性(r=0.400，P>0.05)。

3 討論

CRT是一種主要存在于內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)的結構高度保守的分子伴侶和鈣離子結合蛋白，參與了人體多種生理和病理過程[6]。CRT在許多疾病中都有異常表達，例如類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[7]、心血管疾病等。目前已被證實CRT在多種腫瘤組織中呈高表達， CRT在胃癌中表達升高，且高表達的CRT會導致胃癌細胞的增殖和遷移，同淋巴結轉移相關，并且具有較差的預后[8]；在乳腺癌中CRT的表達明顯升高，并且惡性程度越高的細胞中CRT表達越高，Ⅲ期和Ⅳ期表達較Ⅰ期和Ⅱ期明顯升高[9]；在NSCLC中，有研究報道[3]顯示：CRT在鱗癌和腺癌均呈高表達，而小細胞肺癌中CRT的表達較鱗癌和腺癌卻明顯降低；王富強等[10]采用免疫印跡的方式檢測NSCLC組織中CRT蛋白水平，結果發(fā)現(xiàn)CRT同NSCLC患者的淋巴結轉移和TNM分期相關，但是目前尚未見通過免疫組化檢測NSCLC患者中CRT的表達同淋巴結轉移和臨床分期的報道；研究[11]證實，CRT在NSCLC的高表達導致抗腫瘤免疫細胞(如樹突狀細胞等)的累積增加，進而引起抗腫瘤免疫反應，加強常規(guī)抗腫瘤治療(放療和化療)的治療效果，從而對NSCLC患者的預后有較大幫助。Liu等[12]研究進一步發(fā)現(xiàn)，CRT可以作為佐劑促進樹突細胞成熟，并且增強針對NSCLC的黑素瘤相關抗原3(MAGE-A3)的特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答。在NSCLC中，CRT介導的效應記憶T細胞主要是CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞，這些T細胞更趨向效應記憶表型，效應記憶T細胞記憶的細胞毒性可以控制原發(fā)腫瘤進展和轉移，因此而被認為可以控制癌癥的進展[13]；另一方面，Stoll等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CRT表達缺失的NSCLC患者預后較差。

CRT通過影響細胞黏附、遷移和侵襲從而進一步影響腫瘤轉移的過程，CRT促進細胞黏附的機制主要是通過和整合素之間的相互作用而完成的，整合素的作用是連接細胞外基質和細胞內(nèi)的細胞骨架以及觸發(fā)由內(nèi)向外、由外向內(nèi)的信號轉導，CRT結合整合素可能影響整合素-細胞骨架之間的相互作用，從而影響細胞黏附的能力[15]，此外有研究證實鈣網(wǎng)蛋白可以通過影響胰島素受體底物1(IRS-1)磷酸化的差異而影響細胞粘附的能力[16]。由此可以看出，CRT可以通過促進細胞粘附和遷移從而影響NSCLC的發(fā)展。

BAP31是一種定位于內(nèi)質網(wǎng)膜的多功能蛋白質，其可以通過與免疫球蛋白(mIgM和mIgD)結合而影響其功能，并且激活B淋巴細胞[17,18]，參與了許多重要蛋白質在內(nèi)質網(wǎng)的跨膜轉運，并且可以介導細胞凋亡等，但BAP31只在人體部分正常組織中低表達(除睪丸組織外)[19]，其陽性產(chǎn)物定位于胞質，是蛋白質分子轉運過程中的重要載體蛋白。1996年，Li等[20]首次發(fā)現(xiàn)了BAP31在乳腺癌中表達明顯升高；隨后Yu等[21]發(fā)現(xiàn)，BAP31在絕大多數(shù)惡性黑色素瘤中呈高表達，其總陽性率達86.5%；我國學者董令儀等[22]研究了BAP31在結直腸癌中的表達情況，研究表明BAP31在結直腸癌中的表達陽性率為64.17%，明顯高于黏膜組織中的6.67%，高分化和沒有遠處轉移的結直腸癌患者中BAP31的表達較低分化以及有遠處轉移的患者更高，并且發(fā)現(xiàn)BAP31表達陰性患者的總體生存率明顯低于BAP31陽性表達的患者，說明BAP31可能參與了腫瘤細胞的發(fā)展過程，可能BAP31的高表達能夠通過一些通路阻止腫瘤細胞的侵襲和遷移，或者其介導的腫瘤免疫有利于患者的預后，這其中的機制尚未闡明，有待進一步的研究。但是，目前BAP31在NSCLC中的表達無相關研究報道。

本研究通過免疫組化法檢測CRT、BAP31在NSCLC組織中的表達，并分析其表達水平同患者年齡、性別、吸煙、病理類型、有無淋巴結轉移和臨床分期的關系，結果顯示NSCLC組的CRT和BAP31表達水平明顯升高，在正常肺組織中和癌旁組織中也有微量表達，說明CRT可能參與了NSCLC形成的過程，可能成為NSCLC的一個獨立預測因子；Ⅲ+Ⅳ期患者較Ⅰ+Ⅱ期患者CRT的表達更強，說明CRT的表達與NSCLC淋巴結轉移相關，并同TNM臨床分期相關，提示CRT可能參與了NSCLC的進展過程，之前有研究報道[10]使用免疫印跡方式檢測CRT在NSCLC的表達，發(fā)現(xiàn)CRT在有淋巴結轉移組較沒有淋巴結轉移組明顯升高，ⅢA期較Ⅰ期、Ⅱ期明顯升高，此結果與之前研究結果一致。因此說明CRT可能成為潛在的診斷NSCLC的標志物，并且其陽性表達與淋巴結轉移和TNM分期相關，表明其可能參與了NSCLC的進展過程。BAP31在NSCLC中的表達同一系列臨床參數(shù)無明顯相關性，這些實驗結果同前面研究報道[22]BAP31在結直腸癌中的表達結果相一致；目前，BAP31在NSCLC中發(fā)生、發(fā)展的具體機制尚未闡明，需進一步研究探討。

BAP31作為一種內(nèi)質網(wǎng)膜蛋白，在CRT移位至細胞膜表面的過程中起了重要作用[23]，BAP31是CRT膜轉位中必不可少的物質，阻斷其介導的CRT膜轉位通路，比如BAP31表達缺失的情況下，CRT將不能移位至腫瘤細胞膜表面，從而消除了腫瘤細胞凋亡的免疫原性，減弱腫瘤放療或化療引起的抗癌免疫反應。由此可以看出，CRT和BAP31在介導NSCLC的腫瘤免疫過程中起了協(xié)同作用，研究二者在NSCLC中的表達相關性可能為研究NSCLC免疫治療提供新的方向。本研究通過對CRT和BAP31在NSCLC中表達的相關性分析發(fā)現(xiàn)，兩者對應的總體相關系數(shù)無統(tǒng)計學意義，說明此兩指標無明顯相關關系，可能跟實驗樣本量偏小有關，更大樣本量以及更精細的分期的研究或許更有利于分析二者在NSCLC中表達的相關性。

總之，CRT和BAP31在NSCLC中均呈高表達，二者可能均參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展以及遠處轉移，并且都與腫瘤免疫密切相關，因此CRT和BAP31可能成為診斷NSCLC新的生物標志物，并且有望成為免疫檢測和治療的新靶點，二者介入NSCLC的機制尚未完全闡明，有待進一步的研究證實。