干瑤，范紹輝 ，陳艷琳，程海飛，王紅嫚

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東珠海 519100)

急性肺損傷(ALI)是由各種病因?qū)е碌募毙詮浡苑闻菝?xì)血管損傷的一種臨床綜合征，是呼吸系統(tǒng)危重癥之一，其發(fā)病率和病死率均較高，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是該病的嚴(yán)重階段。2012年ARDS新的診斷標(biāo)準(zhǔn)(柏林定義)中取消了ALI命名，將ARDS的氧合狀態(tài)涵蓋ALI的范疇。有研究[1]表明，大部分ALI患者在住院2～5 d發(fā)生。目前，臨床治療ARDS的常規(guī)措施是治療原發(fā)病、機(jī)械通氣和對癥支持治療。雖有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肌肉阻滯劑、糖皮質(zhì)激素、他汀藥物及基因與間充質(zhì)干細(xì)胞治療等對改善ARDS病情有幫助[2]，但仍未得到廣泛認(rèn)可。由于ARDS病因多樣、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚無特效藥物治療該病，所以探索針對ARDS的特異性藥物顯得尤為重要。失控的炎癥反應(yīng)是現(xiàn)今公認(rèn)的ARDS發(fā)病機(jī)制，中性粒細(xì)胞(PMNs)是ARDS主要效應(yīng)細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中PMNs首先被招募到炎癥部位，參與抵御病原微生物[3]，而過量PMNs被激活、遷移、聚集到肺泡腔和肺間質(zhì)是ARDS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，且PMNs數(shù)量與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[4]。PMNs從血管轉(zhuǎn)移到炎癥部位要經(jīng)歷滾動(dòng)、黏附、趨化等過程，而趨化作用顯得尤為重要[5]。巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(MIP-2)和白介素-8(IL-8)屬于趨化因子成員，與PMNs募集到炎癥部位密切相關(guān)。本研究觀察了ARDS小鼠肺組織MIP-2、IL-8 mRNA表達(dá)及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中PMNs百分比，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康C57BL/6小鼠64只，周齡8～10周，體質(zhì)量18～22 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。脂多糖[6，7]購于美國Sigma公司，TRIzol購于美國Invitrogen公司，SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)和Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)購于日本TaKaTa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、ARDS模型制備及肺組織取材 將64只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為觀察組40只和對照組24只。觀察組小鼠經(jīng)鼻滴入50 μL脂多糖(20 mg/mL)，對照組滴入等量PBS溶液。通過觀察小鼠一般情況、肺組織病理損傷、肺濕/干(W/D)重比值來判斷肺損傷程度、肺水腫情況。觀察組造模后12、24、48、72 h各取10只小鼠，對照組上述時(shí)點(diǎn)各取6只小鼠，經(jīng)異氟烷(100 mg/kg)吸入麻醉，取肺組織。

1.3 肺組織MIP-2、IL-8 mRNA檢測 采用qPCR法。采用TRIzol法提取RNA，取50～100 mg肺組織加入1 mL的TRIzol試劑在冰上研磨，提取總RNA；微量分光光度計(jì)測定OD值，OD260/OD280值在1.8～2.0，為所需RNA純度，再將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；qPCR檢測4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各樣本MIP-2、IL-8 mRNA，反應(yīng)條件: 95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，72 ℃、30 s，總共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束后，分析各基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，獲得各樣本的循環(huán)閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt相對定量法計(jì)算結(jié)果。用PRIMER5軟件/NCBI在線設(shè)計(jì)MIP-2特異性引物，上游引物5′-GCTGTCCCTCAACGGAAGAA-3′，下游引物5′-CAGGTACGATCCAGGCTTCC-3′，擴(kuò)增片段為72 bp；IL-8特異性引物，上游引物5′-GGGTGGGGAGTTCGTGTAGA-3′，下游引物5′-CTACTACACAGGGATCAGGGC-3′，擴(kuò)增片段為85 bp。

1.4 BALF中PMNs百分比測算 取1 mL生理鹽水灌洗雙側(cè)肺組織，反復(fù)灌洗3次，每次回抽率達(dá)70%～80%。將收集的BALF用冰凍離心機(jī)以1 200 r/min的速度在4 ℃環(huán)境下離心10 min，棄上清液，吸取細(xì)胞沉渣涂于細(xì)胞計(jì)數(shù)板，瑞氏染色，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，分別計(jì)算出總白細(xì)胞數(shù)和總PMNs數(shù)，最后求出PMNs百分比。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時(shí)點(diǎn)肺組織MIP-2、IL-8 mRNA相對表達(dá)量比較 結(jié)果見表1。

表1 兩組不同時(shí)點(diǎn)肺組織MIP-2、IL-8 mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組BALF中PMNs百分比比較 結(jié)果見表2。

表2 兩組BALF中PMNs百分比比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

ARDS是一種起病迅速，病情兇險(xiǎn)疾病，其主要病理特征為肺微血管通透性增高，大量富含蛋白質(zhì)液體和炎癥細(xì)胞滲出到肺泡腔和間質(zhì)聚集，肺泡壁逐漸增厚及肺微血管充血、出血[8]。ARDS病理生理表現(xiàn)為肺不張、肺順應(yīng)性降低及嚴(yán)重的通氣/血流失衡，臨床表現(xiàn)為頑固性低氧和呼吸窘迫。隨著ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)的不斷完善，使臨床上ARDS確診率不斷提高，但病死率仍居高不下。失控的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是ARDS最有可能的發(fā)病機(jī)制，但當(dāng)前仍缺乏有效治療ARDS藥物，而細(xì)胞、分子水平是現(xiàn)今研究ARDS機(jī)制熱點(diǎn)。

趨化因子在炎癥條件下可調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和活性，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)不同分為CXC、CC、C、CX3C四個(gè)亞家族[9]，其中CXC亞家族在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ARDS中，將PMNs募集到肺組織扮演著重要的角色，尤其是成員CXCL2(MIP-2)和CXCL8(IL-8)[10,11]。MIP-2是一種強(qiáng)效的中性粒細(xì)胞趨化因子，在IL-1β、TNF-α等刺激下主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它的產(chǎn)生能引發(fā)PMNs募集，促進(jìn)炎癥進(jìn)一步發(fā)展[12]。在炎癥反應(yīng)中，MIP-2能激活PMNs增加其細(xì)胞表面黏附分子CD11b的表達(dá)[13]，促進(jìn)PMNs對血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，利于PMNs從血管內(nèi)滲出、聚集到炎癥部位。MIP-2對PMNs作用受P38MAPK信號通路的調(diào)節(jié)，抑制P38MAPK可減弱MIP-2的作用[14]。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，使用抗MIP-2抗體可以抑制CD11b表達(dá)和PMNs在肺內(nèi)的聚集，減輕肺水腫。本研究顯示，與對照組比較，觀察組12、24、48、72 h的MIP-2 mRNA相對表達(dá)量增加。說明MIP-2在ARDS肺組織存在高表達(dá)，炎癥早期即開始表達(dá)。

IL-8由多種炎癥細(xì)胞分泌，是一種高選擇性的促炎性趨化因子，在人類和動(dòng)物中的各種炎癥性疾病中均有升高[11]，被認(rèn)為是典型的中性粒細(xì)胞趨化因子[16]，對PMNs具有趨化和激活作用。曾有研究認(rèn)為，IL-8在ARDS中參與了至少70%PMNs趨化活動(dòng)[17]。正常生理情況下，PMNs在循環(huán)系統(tǒng)中半衰期較短(6～8 h)，細(xì)胞程序性凋亡可去除衰老細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，PMNs凋亡在SIRS、膿毒血癥和ARDS中有所減少，PMNs壽命延長會(huì)加重組織損傷[4]。因?yàn)镻MNs凋亡有減輕炎癥反應(yīng)作用，故可能會(huì)對ARDS有抑制作用[4,18]。有研究發(fā)現(xiàn)，在ARDS患者BALF中可檢測出抗-IL-8自身抗體，其與IL-8結(jié)合形成抗-IL-8:IL-8抗體復(fù)合物，該復(fù)合物有延長PMNs壽命作用，可能對PMNs凋亡有抑制作用[19]，故IL-8不僅可以趨化、激活PMNs，還參與了抑制PMNs凋亡作用。本研究顯示，與對照組比較，觀察組12、24、48、72 h的IL-8 mRNA相對表達(dá)量增加。說明IL-8 mRNA在ARDS肺組織存在高表達(dá)，參與早期炎癥反應(yīng)。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，在兔ARDS模型中使用人抗IL-8抗體后，可阻止PMNs在肺組織滲出浸潤，改善ARDS疾病的臨床癥狀。

PMNs是炎癥反應(yīng)重要組成部分，活化的PMNs在肺泡腔和肺間質(zhì)中不斷累積是導(dǎo)致ARDS早期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[21]；消除PMNs可顯著降低動(dòng)物模型中急性肺損傷的嚴(yán)重程度[22]。本研究對小鼠鼻內(nèi)緩慢滴入脂多糖溶液造成肺部直接損傷。進(jìn)入機(jī)體的脂多糖與巨噬細(xì)胞細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等炎癥細(xì)胞表面的Toll樣受體4、CD14、髓樣分化蛋白-2組成的復(fù)合物受體識(shí)別、結(jié)合，使下游的NF-κB和MAPK信號通路激活，導(dǎo)致IL-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放[23]進(jìn)而激活大量PMNs，使其在炎癥部位滲出浸潤，釋放氧自由基、蛋白水解酶及多種炎癥介質(zhì)造成肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同時(shí)釋放出的炎癥介質(zhì)再反過來作用于巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和PMNs等未激活的炎癥細(xì)胞，最終形成一種瀑布式樣的炎癥反應(yīng)，對機(jī)體造成廣泛地致命性傷害?？梢奝MNs在ARDS疾病進(jìn)展中的重要性。本研究顯示，與對照組比較，觀察組12、24、48、72 h的PMNs百分比增加。隨著造模時(shí)間延長，PMNs百分比值與MIP-2和IL-8 mRNA表達(dá)水平呈同步增減的關(guān)系，PMNs的激活、肺內(nèi)聚集可能受這兩種趨化因子調(diào)節(jié)， 同時(shí)MIP-2和IL-8可能在維持炎癥進(jìn)展中起重要作用。

總之，MIP-2、IL-8在ARDS小鼠中存在高表達(dá)，在小鼠ARDS炎癥早期即開始參與反應(yīng)，可能對PMNs有趨化和激活作用，同時(shí)亦可能在維持炎癥進(jìn)展中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)使用抗MIP-2和抗IL-8抗體可減少PMNs在肺組織中聚集，改善 ARDS病情。