于慶偉，秦彥昌，張百平，羅國強

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710038 )

膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其中70%屬于高病理分級，患者術(shù)后復(fù)發(fā)率和病死率均很高[1]。盡管科研工作者一直致力于探索更有效的治療方法，但由于腫瘤細胞的多樣性和高侵襲力以及膠質(zhì)瘤患者的異質(zhì)性，膠質(zhì)瘤目前仍然是人類最致命的癌癥之一，膠質(zhì)母細胞瘤患者中位生存期甚至只有12月[2-3]。影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后因素包括：卡氏行為狀態(tài)評分 (KPS) 、組織學(xué)分級以及術(shù)后復(fù)發(fā)[4-5]。但目前已有研究表明，單獨的標準可能不足以估計患者預(yù)后，因此需要探索一種生物標志物和治療靶點，可進行早期診斷并且可以更準確的預(yù)測預(yù)后[4-5]。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)被廣泛定義為長度大于200個核苷酸并且缺乏開放閱讀框架的RNA分子[9-10]。目前，它已被發(fā)現(xiàn)涉及大腦的進化、發(fā)展和一些疾病過程，并可用作治療和診斷的新的生物標志物和靶點[11]。之前有研究表明，通過篩選轉(zhuǎn)錄表達譜發(fā)現(xiàn)lncRNAs在膠質(zhì)瘤組織的表達可發(fā)生顯著改變[12]。此外, lncRNAs與膠質(zhì)瘤的發(fā)展和調(diào)節(jié)細胞生長和轉(zhuǎn)移的進展有關(guān)，表明lncRNAs在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。例如研究者證實，過表達的DANCR可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進膠質(zhì)瘤的惡性進展[13]。還有實驗顯示lncRNA-ZEB1-AS1的下調(diào)可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[14]。肌動蛋白絲相關(guān)蛋白1反義RNA1(AFAP1-AS1), 位于人的 4 號染色體肌動蛋白絲相關(guān)蛋白1(AFAP1)基因反義鏈上，是一個長度約6810 bp的一種長鏈非編碼RNA，已經(jīng)有相關(guān)研究顯示AFAP1-AS1 的表達水平與消化系統(tǒng)腫瘤(胃癌、膽囊癌、食管癌、結(jié)直腸癌等)的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移以及患者臨床參數(shù)和預(yù)后都密切相關(guān)[15-18]。然而目前我們對lncRNA AFAP1-AS1在膠質(zhì)瘤中的作用以及對患者預(yù)后的影響所知甚少。為了確定lncRNA AFAP1-AS1表達在膠質(zhì)瘤中的臨床意義, 我們分析了AFAP1-AS1表達與臨床病理特征的關(guān)系, 包括與患者的生存率的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中AFAP1-AS1表達水平高于正常腦組織。此外, lncRNA AFAP1-AS1的表達與膠質(zhì)瘤患者的惡性狀況和不良預(yù)后都密切相關(guān)。

對象與方法

1 研究對象 回顧性統(tǒng)計空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科2008年1月到2013年1月共70例腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除術(shù)患者的臨床資料。選擇標準：①患者沒有其他腫瘤病史；②具備完整的臨床數(shù)據(jù)，包括：年齡、性別、平均腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、病理分級、KPS評分、術(shù)后復(fù)發(fā)情況；③正常腦組織樣本從同期入院進行顱腦內(nèi)減壓術(shù)治療的患者中獲得；④患者術(shù)前均未進行放、化療治療或其他抗癌治療；⑤所有入選患者均簽署知情同意書，自愿參與本研究；⑥獲得本院倫理委員會批準。對參與的患者進行5年的隨訪, 隨訪方式為門診復(fù)診或進行電話隨訪，統(tǒng)計患者從最初的手術(shù)到死亡的日期計算了整體存活率，隨訪截止時間2018年1月。其中因意外事故或因與膠質(zhì)瘤無關(guān)的情況而死亡的患者被排除。

2 研究方法 組織在切除后立即凍結(jié), 儲存在液氮中。采用Trizol 法 (Invitrogen, CA, USA)提取組織標本中的總RNA，然后用紫外分光光度計測定組織標本在波長為260 nm以及280 nm 處的吸光度比值OD 260/280，計算RNA濃度并評估純度，RNA樣品OD值在1.9～2.0范圍內(nèi)為合格。取 1 μl上述組織總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)參數(shù)：37 ℃ 反應(yīng) 15 min (反轉(zhuǎn)錄)，85 ℃ 反應(yīng) 5 s。然后應(yīng)用 RT-PCR法分別檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織標本中AFAP1-AS1的表達水平，內(nèi)參基因設(shè)置為GAPDH。引物及探針序列如下：AFAP1-AS1上游引物正向: 5’-AGCCTTGGTGAGCAATAGGT-3’, 下游引物反向: 5’-GGTATGAAGGGTGTGGGTGA-3’, GAPDH上游引物正向: 5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’,下游引物反向: 5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’。然后采用2-ΔΔCt法對測得的數(shù)據(jù)進行相對定量分析，計算AFAP1-AS1在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織的不同表達水平，所有實驗均重復(fù)3次以上。

結(jié)果

1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中AFAP1-AS1表達水平 為了確定AFAP1-AS1在膠質(zhì)瘤中的作用，我們應(yīng)用RT-PCR檢測其在組織中的表達情況(圖1)。結(jié)果顯示，與相鄰腦正常組織相比, 膠質(zhì)瘤組織表現(xiàn)出較高的表達水平[膠質(zhì)瘤組織(2.881±0.273)、正常腦組織(1.000±0.313)，P=0.0007]。同時通過數(shù)據(jù)對比，AFAP1-AS1的表達水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高而增高[WHO I～II級(2.250±0.288)、WHO III～IV級(3.512±0.294)，P=0.012]，說明AFAP1-AS1的表達水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。

圖1 LncRNA-AFAP1-AS1在腦組織和腫瘤組織中的表達水平

2 AFAP1-AS1表達與膠質(zhì)瘤臨床病理指標的相關(guān)性 見表1?；谒心z質(zhì)瘤的中位表達水平，我們將膠質(zhì)瘤組織標本分為低表達組(n=38)和高表達組(n=32)。結(jié)果顯示：神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達水平的AFAP1-AS1與高病理分級(P=0.029)、低KPS 評分(P=0.015)以及患者術(shù)后復(fù)發(fā)(P=0.021)有密切關(guān)系，而與患者的年齡(P=0.729)、性別(P=0.762)以及腫瘤大小(P=0.934)等均無關(guān)。

表1 LncRNA-AFAP1-AS1表達水平與膠質(zhì)瘤患

3 AFAP1-AS1的表達水平與膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的關(guān)系 為了探討AFAP1-AS1表達水平在膠質(zhì)瘤患者中的預(yù)后價值, 利用 Kaplan-Meier分析并進行Log-rank試驗, 分析AFAP1-AS1表達水平與患者生存率的關(guān)系(圖2)。在70例膠質(zhì)瘤患者中, 我們發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1表達與膠質(zhì)瘤患者整體生存率成反比。換言之, AFAP1-AS1表達下降的患者總存活率優(yōu)于AFAP1-AS1表達上升的患者。此外, 我們還發(fā)現(xiàn), AFAP1-AS1的過度表達在膠質(zhì)瘤患者中表現(xiàn)出明顯不良的預(yù)后情況, 無論其等級、腫瘤大小和腫瘤位置如何。進一步研究AFAP1-AS1的表達是否是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立因素，以及探索其他可能影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后的因素。我們將各患者臨床病理指標與生存率進行了單因素和多因素COX比例風(fēng)險回歸分析。分析結(jié)果顯示：高表達水平的AFAP1-AS1、高組織學(xué)分級、KPS評分<80分以及術(shù)后復(fù)發(fā)均為造成膠質(zhì)瘤患者不良臨床預(yù)后的獨立危險因素，見表2。

圖2 LncRNA-AFAP1-AS1高表達組和低表達組患者術(shù)后5年生存情況

臨床病理特征 單因素分析風(fēng)險比 (95% CI)P值 多因素分析風(fēng)險比 (95% CI)P值年齡 (<50、≥50歲) 1.012(0.687～1.948)0.274 1.744(0.954～3.221)0.079性別 (男、女) 0.974(0.559～1.542)0.304 0.908 (0.586～1.702)0.322腫瘤直徑 (<4、≥4 cm) 1.545(0.864～2.889)0.136 1.245(0.745～2.351)0.214AFAP1-AS1表達水平 (低、高) 2.591(1.349～4.921)0.009 2.446 (1.334～4.647)0.012組織學(xué)分級 (I～II、III～IV) 2.312(1.297～4.507)0.014 2.864(1.502～5.554)0.003KPS評分 (低、高) 2.030(1.102～3.931)0.020 2.987(1.599～5.846)0.001術(shù)后復(fù)發(fā) (是、否) 2.161(1.201～4.014)0.018 2.543 (1.397～4.886)0.010

討論

LncRNAs通常被認為是一種轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物，沒有蛋白質(zhì)編碼能力。但越來越多的證據(jù)表明lncRNAs廣泛參與了各級基因表達的調(diào)控, 在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后處理等多種類型的生物過程中起到重要作用，是目前遺傳學(xué)研究的熱點[19]。近幾十年來, 據(jù)報道, 在致癌過程和癌癥進展中，經(jīng)常觀察到反常表達的lncRNAs，這表明失調(diào)的lncRNAs可能作為早期癌癥診斷的新的生物標志物，可以作為惡性腫瘤的有效治療指標和預(yù)后預(yù)測靶點。例如, lncRNA HULC和lncRNA ZFAS1的高水平表達都可以促進肝細胞癌(HCC)的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[20]。而AFAP1-AS1作為AFAP1反義鏈上的 lncRNA，研究證明其可能通過影響 AFAP1對生理病理進程的調(diào)控，在分子機制上影響肌動蛋白與其它蛋白的連接，進而影響細胞的吞噬、運動及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)在舌鱗癌組織中，AFAP1-AS1的表達明顯高于癌旁組織，在沉默AFAP1-AS1的表達后，舌癌細胞的增殖能力減弱，且細胞周期阻滯。此外Lu等[23]發(fā)現(xiàn)，AFAP1-AS1在肝癌組織中的表達上調(diào)，而且其高表達與腫瘤直徑、血管浸潤、臨床TNM分期和預(yù)后有關(guān)，說明AFAP1-AS1在肝癌的進展中發(fā)揮著致癌基因的作用。但是，AFAP1-AS1在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達量和對患者臨床預(yù)后的作用卻沒有相關(guān)科研報道。

在我們的研究中，我們檢測到AFAP1-AS1在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的不同表達水平，發(fā)現(xiàn)相較于正常腦組織，AFAP1-AS1在膠質(zhì)瘤組織中呈高水平表達，這提示我們AFAP1-AS1可以影響膠質(zhì)瘤的發(fā)展和進展。接下來我們探討AFAP1-AS1與膠質(zhì)瘤臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1過表達與KPS評分以及是否復(fù)發(fā)有關(guān)，并且也與WHO分級呈正相關(guān)。而與患者年齡、性別以及腫瘤直徑等均無關(guān)。因此, 我們推測高表達AFAP1-AS1在膠質(zhì)瘤中可加速腫瘤生長, 增強局部細胞侵襲和轉(zhuǎn)移, 調(diào)節(jié)細胞分化。最后根據(jù)我們的隨訪數(shù)據(jù)，AFAP1-AS1高表達組患者的5年生存率要明顯低于AFAP1-AS1低表達組。同時我們的研究證實AFAP1-AS1在腫瘤組織中的高表達、高病理級別、KPS評分<80分以及術(shù)后復(fù)發(fā)等均可作為評價膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的獨立因素。

綜上，本研究中我們證實了AFAP1-AS1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達水顯著增高，而高表達水平的AFAP1-AS1與膠質(zhì)瘤患者的不良臨床預(yù)后有關(guān)，可作為預(yù)測膠質(zhì)瘤患者術(shù)后預(yù)后的獨立因素和膠質(zhì)瘤診斷的新的生物標志物。在未來，需要有更多的研究來驗證AFAP1-AS1作為可靠的臨床預(yù)測指標對于膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的作用。同時AFAP1-AS1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制，以及可能參與的傳導(dǎo)通路及分子作用靶點，也需要我們進一步深入研究。