郭曉雅，宋立強，梁家寧，楊學(xué)敏，陳 潔

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(西安710032)

急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)的病死率仍居高不下，是危重癥醫(yī)學(xué)臨床救治的難點，主要原因是其發(fā)病機制仍不明確[1]。目前認為以中性粒細胞聚集和活化為中心的、其它炎癥細胞相繼參與的瀑布式炎癥反應(yīng)，是ARDS的主要病理生理特征，但啟動機制遠未闡明[2]。其中病原體直接感染呼吸道引發(fā)的肺內(nèi)型ARDS是主要臨床類型，約占57%[3-4]。氣道上皮細胞是重要的肺臟結(jié)構(gòu)細胞，直接與外界環(huán)境接觸，是肺臟的第一道防御屏障。其中，氣道上皮中杯狀細胞的角色日益受到關(guān)注。在外界因子刺激下，它參與反應(yīng)迅速的黏液-纖毛清除系統(tǒng)工作，應(yīng)激狀態(tài)下還能“旁分泌”一種特異性鈣激活Cl-通道蛋白(Calcium-activated chloride channel, CLCA)。后者在人類和小鼠的基因型分別是hCLCA1和mCLCA3，兩者異種同源。最初認為CLCA是跨膜蛋白，目前確認CLCA是分泌型蛋白，其裂解的N端肽段對Cl-通道具有調(diào)節(jié)作用，能調(diào)節(jié)黏液蛋白的合成[5-6]。近年多項研究證實，“產(chǎn)生過量”的CLCA與氣道炎癥性疾病(包括哮喘、COPD和肺囊性纖維化等)的發(fā)生及程度密切相關(guān)[7-10]。目前未能檢索到CLCA與ARDS相關(guān)性的研究報道。基于此，本課題組擬探討氣道上皮分泌的CLCA在ARDS發(fā)生機制中的變化及作用，本實驗從體外細胞水平初步探討其作用，旨在為臨床ARDS的防治提供新的靶點。

資料和方法

1 材 料

1.1 細胞系：本實驗使用正常人支氣管上皮細胞HBE細胞系，購自ATCC并由實驗室培養(yǎng)并保存。

1.2 試 劑：1%戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國)；LPS(Escherichia coli055:B5)(Sigma公司，美國)；生理鹽水(saline)(Sigma公司，美國)；DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國)；胎牛血清(FBS)(GIBCO公司，美國)；胰酶(GIBCO公司，美國)；DEPC水(北京天為時代科技公司 )；Trizol細胞裂解液(Invitrogen公司，美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司，日本)；SYBR Green Real-time PCR Master(TOYOBO公司，日本)；real-time RT-PCR mCLCA3 引物(上海生工生物工程有限公司)；real-time RT-PCR β-actin 引物(上海生工生物工程有限公司)；兔抗鼠mCLCA3一抗(Abcam公司，美國)；鼠抗鼠β-actin一抗(Abcam公司，美國)；山羊抗兔二抗(Abcam公司，美國)；山羊抗鼠二抗(Abcam公司，美國)；蛋白酶抑制劑Cocktail(Sigma公司，美國)；RIPA 裂解液(碧云天公司，中國)；BCA 蛋白試劑盒(Bio-Rad公司)；Western Blot相關(guān)試劑(碧云天公司，中國)；4×Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad公司)；Millipore chromogenic kit顯影液(Billerica公司)。由Primer5.0軟件設(shè)計TNF-α(Gene-ID 21926)、IL-1β(Gene-ID 16176)引物，由上海生工生物工程有限公司合成。TNF-α上游引物為5-TATGTCTCAGCCTCTTCTCA-3，下游引物為5-GCCATAGAACTGATGAGAGG-3，產(chǎn)物長度為133bp。IL-1β上游引物為5-CTTTTCGTGAATGAGCAGAC-3，下游引物為5-CTCTTTGAACAGAATGTGCC-3，產(chǎn)物長度為107bp。內(nèi)參基因β-actin(Gene-ID 11461)引物由上海生工生物工程有限公司合成。β-actin上游引物序列是：5-TGTATGAAGGCTTTGGTCTC-3，下游引物序列是：5-GGTGTGCACTTTTATTGGTC-3，產(chǎn)物長度為96bp。

2 實驗方法

2.1 正常人支氣管上皮細胞HBE細胞系培養(yǎng)：本實驗使用正常人支氣管上皮細胞HBE細胞系，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(雙抗)的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃的孵箱中培養(yǎng)。

2.1.1 運用LPS刺激HBE細胞系：每孔加入無FBS的DMEM培養(yǎng)基，饑餓6h。利用LPS(10mg/ml)過濾，避光。按照每孔1μg/ml的量進行刺激。將實驗共分四組，每組設(shè)三個復(fù)孔，分別為生理鹽水組(saline組)、LPS刺激持續(xù)6h組(LPS-6h組)、LPS刺激12h(LPS-12h組)和LPS刺激24h(LPS-24h組)。

2.1.2 Western Blot檢測hCLCA1蛋白在HBE細胞系中的表達。

2.2 RIPA法提取HBE細胞系總蛋白：棄培養(yǎng)基，用冷PBS洗細胞3次。加入適量RIPA裂解液(使用前數(shù)分鐘向20 ml RIPA中加入兩片蛋白酶抑制劑Cocktail)，置于冰上。用干凈的刮子將細胞刮至一側(cè)，然后移入EP管中，-80℃冰融1次。取出，解凍，12000 rpm低溫離心5 min。 取上清，并移入新EP管中，-80℃保存。之后煮蛋白：依照測得的蛋白濃度，按照上樣量為25 μg計算上樣體積(μl)，分裝于10個小EP管中。每管加入5×sample beffer(提前解凍)，其體積為蛋白體積/4，即稀釋為1×?；靹?，離心，上機，程序為：Run-Main-DB(95℃，5 min)。

2.3 Western Blot法檢測HBE細胞系中hCLCA1蛋白的表達：蛋白電泳時，每孔上樣量10 μl，通過Western Blot法檢測HBE細胞系中hCLCA1蛋白的表達情況。

2.4 hCLCA1-siRNA轉(zhuǎn)染HBE細胞系：實驗分為陰性對照組(NC組)、空白對照組(Control組)、轉(zhuǎn)染組(hCLCA1-siRNA組)、刺激組(LPS組)和轉(zhuǎn)染+刺激組(hCLCA1-siRNA+LPS組)。將HBE細胞接種于12孔板，用不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，待細胞長至80%～90%轉(zhuǎn)染hCLCA1-siRNA。用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，加入Lipofectamine 2000，輕輕混勻；在5 min之內(nèi)將稀釋的Lipofectamine 2000分別與hCLCA1-siRNA輕輕混勻，室溫靜置20 min；將轉(zhuǎn)染試劑混合液分別加入每個孔內(nèi)，輕搖孔板混勻；37℃的CO2孵箱里孵育4～6 h，換成含血清DMEM培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，加或不加LPS處理細胞24 h，收集mRNA與細胞蛋白，低溫保存。

2.5 利用real-time RT-PCR法鑒定hCLCA1基因是否被特異性抑制。

2.5.1 HBE細胞系總RNA提取：用0.1%DEPC水消毒實驗耗材，烘干備用。收集HBE細胞，PBS灌洗3次。棄去PBS，每孔加入1mlTrizol裂解液，吹打至細胞脫壁，移入新去酶EP管中。反復(fù)冰融一次讓細胞充分裂解。

2.5.2 檢測HBE細胞系總RNA濃度：將提取好的總RNA混勻，瞬離后取2μl RNA加入98μl DEPC水中，即稀釋50倍，混勻上機。OD(260/280)值低于1.8提示蛋白質(zhì)污染嚴重；高于2.0提示RNA降解嚴重。選取OD值在1.8～2.0之間且濃度高者為模板進行下一步逆轉(zhuǎn)錄操作。

2.5.3 real-time RT-PCR檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達：利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，通過 real-time RT-PCR引物設(shè)計，通過real-time RT-PCR取得各組樣品后，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測各組細胞系中TNF-α和IL-1β的表達水平。

結(jié)果

1 Western Blot檢測HBE細胞系中hCLCA1蛋白的表達情況 Western Blot法對HBE細胞系進行hCLCA1蛋白表達水平檢測(圖1)，顯影結(jié)果顯示：在約100KD處，LPS-6 h組的HBE細胞系出現(xiàn)條帶與對照組并無差異，而LPS-12h組和LPS-24 h組的HBE細胞系出現(xiàn)條帶的亮度明顯低于對照組，且LPS-24 h組hCLCA1的降低有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，證明hCLCA1蛋白在LPS12 h后的HBE細胞系中表達水平降低，并呈時間依賴性。

2 從mRNA分子水平鑒定hCLCA1基因被特異性抑制 real-time RT-PCR對細胞內(nèi)hCLCA1基因表達檢測，擴增結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染hCLCA1-siRNA后，HBE細胞系中，hCLCA1的mRNA表達水平低于NC組(P<0.05)。hCLCA1基因的表達明顯受到抑制，hCLCA1-siRNA對目的基因的抑制效率達到70%以上(圖2)。

3 real-time RT-PCR法檢測HBE細胞系中炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達情況 real-time RT-PCR對細胞內(nèi)TNF-α和IL-1β基因表達檢測(圖3)，擴增結(jié)果顯示：LPS組細胞中的TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平明顯高于Control組，hCLCA1-siRNA+LPS組細胞中的TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平均明顯高于LPS組細胞(P<0.05)。

圖1 Western Blot檢測HBE細胞系中hCLCA1蛋白表達情況

圖2 real-time RT-PCR檢測細胞內(nèi)hCLCA1基因表達情況

圖3 real-time RT-PCR檢測細胞內(nèi)TNF-α和IL-1β基因表達情況

討 論

ARDS是一種急性、彌漫性、炎癥性肺損傷，其治愈率低，病死率居高不下，是危重癥醫(yī)學(xué)臨床救治的難點。怎樣降低ARDS的發(fā)生率是極其重要的臨床處置思路，實現(xiàn)這一目標的關(guān)鍵點是闡明ARDS失控的炎癥風(fēng)暴的始動機制。目前認為炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)在ARDS的病理生理發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。炎癥反應(yīng)影響了肺泡上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞等組織細胞的結(jié)構(gòu)與功能，后者也參與了ARDS的炎癥反應(yīng)[12]。然而，支氣管上皮細胞在ARDS發(fā)生中的角色還關(guān)注得遠遠不夠。特異性鈣激活氯離子通道蛋白(簡稱CLCA)，系氣道上皮杯狀細胞旁分泌型蛋白。CLCA在哮喘、COPD等慢性炎性疾病中高度活躍，能促進氣道黏液高分泌癥狀的形成，其在這些疾病慢性炎癥發(fā)生中的角色逐漸被人們關(guān)注。近年來多項研究顯示，CLCA也參與肺部感染性炎癥的形成，并與ARDS病情相關(guān)[13-14]。但是，CLCA表達水平與ARDS損傷程度的相關(guān)性及作用機制，目前尚不清楚，本實驗組初步從體外細胞水平探討CLCA在ARDS氣道上皮細胞水平的表達及調(diào)控情況。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革藍氏陰性桿菌細胞壁上促炎的主要成分，可以通過結(jié)合Toll樣受體(TLR4)和激活TLR4-MyD88依賴的信號通路(TLR4-MyD88 dependent signaling pathway)啟動強烈的炎癥反應(yīng)，給動物一定劑量LPS后會引發(fā)動物肺組織內(nèi)細胞因子及趨化因子的產(chǎn)生，隨著炎癥反應(yīng)的加重，導(dǎo)致動物肺內(nèi)型ARDS的發(fā)生。因此常被實驗室用來建立LPS誘導(dǎo)的肺內(nèi)型ARDS模型[15]。 LPS可以直接誘導(dǎo)培養(yǎng)人氣道黏液細胞分泌hCLCA1[16]。本實驗中運用LPS刺激正常人支氣管上皮細胞系(HBE)，觀察hCLCA1蛋白在離體水平的表達情況，為進一步研究CLCA的作用及機制提供理論基礎(chǔ)。

在本研究探討了CLCA在ARDS體外氣道上皮細胞系中的表達情況，以及抑制CLCA后，ARDS體外氣道上皮細胞系中炎癥水平的波動情況。實驗結(jié)果顯示，16HBE細胞系加LPS(1μg/ml)刺激6h后hCLCA1的蛋白表達量與對照組相比無明顯差異，但是在LPS刺激12h后開始下降，在LPS刺激24h后hCLCA1的蛋白表達量明顯低于對照組，其隨時間推移，呈逐漸減少趨勢。本研究中，我們進一步特異性下調(diào)人hCLCA1表達的siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至正常人支氣管上皮細胞HBE細胞系中，觀察到特異性降低hCLCA1的表達后，可提高HBE細胞的炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平。既往多項研究提示CLCA可通過調(diào)節(jié)炎癥細胞參與哮喘、COPD等慢性炎性疾病過程，而且既往我們實驗組發(fā)現(xiàn)，炎癥因子TNF-α和IL-1β在ARDS炎癥損傷的形成和發(fā)展中扮演著重要角色[17]。因此，我們通過本研究可以證實CLCA在體外氣道上皮細胞水平參與了ARDS的炎癥損傷過程，此結(jié)果需進一步的體內(nèi)研究來證實。

鑒于對以上細胞水平實驗結(jié)果，我們推測，CLCA很可能在ARDS的致病過程中能夠保護機體，拮抗炎癥反應(yīng)的發(fā)生。對于CLCA在ARDS動物模型體內(nèi)表達情況，及其如何實現(xiàn)對炎癥因子的反向調(diào)控尚不清楚，我們進一步將繼續(xù)展開體內(nèi)及其分子機制的研究工作。