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(河南農業(yè)大學 林學院，河南 鄭州 450002)

鹽脅迫嚴重影響植物生長發(fā)育過程中的各個代謝路徑，導致細胞膜結構被破壞、植物抗氧化系統(tǒng)失去平衡、植物光合作用和呼吸作用受到抑制，植物的新陳代謝發(fā)生紊亂[1]。光系統(tǒng)對逆境脅迫非常敏感，研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對植物光合作用具有抑制作用，并隨著鹽濃度和脅迫時間的增加，抑制作用更加明顯，鹽脅迫下植物的PSⅡ反應中心活性受到影響[2]。WANG等[3]發(fā)現(xiàn)鹽敏感品種水稻的光抑制作用比非敏感品種明顯。BRUNING等[2]認為，鹽脅迫會抑制PSⅡ的反應，最大光化學效率(Fv/Fm)、光化學猝滅系數(shù)(qP)呈下降趨勢，非光化學猝滅系數(shù)(NPQ)呈上升趨勢，而且NPQ比qP的反應更加敏感。鹽脅迫下，光合過程的電子傳遞和光合速率受到抑制，植株內活性氧大量積累，活性氧清除系統(tǒng)通過清除植物體內的氧自由基、過氧化氫等活性氧，減少活性氧的積累，增強植物的抗鹽性。植物產生大量活性氧，抗氧化酶活性增加，減少活性氧積累，提升植物的抗鹽性[4]。超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內抗氧化酶防御體系中的首道防護線，鹽脅迫下，SOD能夠與其他抗氧化酶共同抵抗外界逆境脅迫[5]。鹽脅迫下，大量的活性氧導致膜脂過氧化，丙二醛(MDA)大量聚集。植物可以通過細胞膜吸收無機鹽離子維持細胞滲透勢[6-7]，也可以通過合成可溶性糖、蛋白質以及氨基酸等保持細胞內水分和細胞完整性[8-9]，從而提高抗鹽性。

脂肪酸各組分的比例能夠影響膜的穩(wěn)定性。目前針對植物脂肪酸的研究主要集中在溫度脅迫方面，有關鹽脅迫的報道相對較少[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫致使小麥根系膜脂不飽和指數(shù)下降[11]，不飽和脂肪酸可提升光合作用的耐鹽性和受損后的修復能力，同時減少逆境脅迫下活性氧傷害[12]。脂肪酸去飽和酶基因在不飽和脂肪酸的合成中具有重要的調控作用，此類酶主要有脂酰-ACP(Acyl-ACP)去飽和酶和脂酰-酯(Acyl-lipid)去飽和酶兩大類。Acyl-ACP去飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase,SAD)能夠對飽和脂肪酸起到催化作用，最終產生單不飽和脂肪酸。此前已有學者從不同植物里克隆出了Acyl-ACP去飽和酶基因[13]。Acyl-ACP去飽和酶包含了ω-6和ω-3兩種酶，通過催化作用與甘油結合的脂肪酸產生雙鍵，調節(jié)膜脂不飽和度。CmFAD2基因是影響ω-6脂肪酸去飽和酶催化途徑的關鍵基因，ω-3脂肪酸去飽和酶基因包含F(xiàn)AD3、FAD7和FAD8三大類基因?，F(xiàn)已經(jīng)從許多植物中克隆得到ω-6和ω-3基因，相關轉基因和表達模式的研究也有較多報道。在對煙草的研究中發(fā)現(xiàn)，過量表達ω-3基因引起耐鹽性有所增強[14]。

菊花(Chrysanthemunmorifolium)有著悠久的栽培歷史，茶用菊是以茶用為主的菊花種類，具有較高的觀賞和經(jīng)濟價值。目前茶用菊與農作物之間的栽培用地之爭愈發(fā)嚴重，研究茶用菊的抗鹽性機制，可以有效地篩選抗鹽性品種，為鹽漬化土地的茶用菊生產提供新思路[15]。目前菊類植物的鹽脅迫探究主要集中在菊芋、藥用菊、野菊以及菊花近緣屬種[16]，有關鹽脅迫下茶用菊的脂肪酸組分變化及抗性機制需要深入探討。前期針對菊花脂肪酸含量及脂肪酸去飽和酶基因表達開展了基礎性研究工作[17-19]，本試驗以茶用菊品種金絲皇菊作為研究對象，通過對NaCl脅迫下其葉片光合特性、抗氧化酶活性與脂肪酸含量，以及3種脂肪酸去飽和酶基因表達量進行測定，分析茶用菊鹽脅迫下的生理響應，為闡明茶用菊的相關抗性機制提供理論基礎，為鹽漬化土地茶用菊的生產提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)和處理

供試材料為茶用菊品種金絲皇菊，選取生長健壯均勻的植株，盆栽基質配比為V(草炭)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=1∶1∶1，每盆栽種1株。待株高為(25±2)cm，葉片數(shù)為(15±1)時，開始進行試驗處理。

試驗共設4個NaCl濃度梯度：0[以清水為對照(CK)]、50、100、200 mmol/L，為避免過高濃度的鹽溶液帶來沖擊效應，NaCl脅迫采取漸進式(對照組除外)，NaCl脅迫濃度以每日50 mmol/L的濃度增加，在同一時間達到不同濃度[15]。達到設定濃度當天為脅迫0 d，在處理的0、3、6、9 d選取植物上部第4～6片完全展開葉完成多個指標的測定，每組重復3次，每重復3盆。

1.2 測定指標和方法

1.2.1 生理指標的測定 葉綠素含量采用乙醇提取法和分光光度計測定，MDA含量用硫代巴比妥酸反應法測定，SOD活性采用氮藍四唑(NBT)顯色法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定，可溶性蛋白含量采用Bradford法測定，游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸法測定[20-21]。

1.2.2 葉綠素熒光參數(shù)的測定 在取樣當天8:00—10:00采用熒光成像儀Fluor Cam對各處理下受光相同的第4～6片完全展開葉進行測定。檢測時將整株菊花放入暗室中暗反應20 min，然后檢測每片葉的最小初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、qP和NPQ。

1.2.3 葉片中脂肪酸組分的測定 脂肪酸組分參照李永華等[17]使用外標法進行測定。新鮮葉片于105 ℃殺青5 min，之后50 ℃烘干。稱量樣品0.2 g，加入100 mL磨口錐形瓶里，加入10%(V/V)硫酸甲醇溶液10 mL，70 ℃水浴中放置30 min。轉移到分液漏斗中，加入20 mL蒸餾水，用正己烷5 mL進行萃取，重復3次，加一定量的無水硫酸鈉進行干燥，過濾膜作為氣相樣品，運用DB-WAXFTLP柱進行氣相檢測(島津氣相)。

測定過程：氮氣作為載氣，流動速度1 mL/min，柱溫140 ℃，維持2 min，然后以每分鐘5 ℃提升溫度至200 ℃，持續(xù)1 min，隨后以每分鐘5 ℃提升溫度至220 ℃，持續(xù)20 min，將樣品與脂肪酸標品(Nu-CheckPrep，Elysian，MN，USA)反應進行對比，樣品進樣溫度225 ℃，檢測器溫度275 ℃。

1.2.4 脂肪酸去飽和酶基因表達量的測定 使用CTAB改良方法得到總RNA，運用電泳和分光光度儀檢測RNA的質量。選取高質量樣品，使用大連寶生物有限公司(TaKaRa)生產的反轉錄試劑盒(Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Erser)進行反轉錄合成cDNA。實驗室前期研究表明，CmSAD、CmFAD2以及CmFAD7是調控同一途徑上的3種脂肪酸去飽和酶基因，且這3種脂肪酸去飽和酶所調控的反應是連續(xù)的。本研究根據(jù)實驗室得到的基因序列，運用Primer Premier 5.0確定實時PCR引物，具體的序列如下：

SAD-F1：5′-TCTGCCAACCTACCAAAC-3′

SAD-R1：5′-TGTCTTCTGAATCTGCCTC-3′

FAD7-F1：5′-AAACCATCAGCTTTGCGGTC-3′

FAD7-R1：5′-CGCAGCTCGAATATCAGCCA-3′

FAD2-F1：5′-TACTTCCTCGCAAACAC-3′

FAD2-R1：5′-TGACCAATGACCCATAA-3′

18S-rRNA-F1：5′-CTCATGGGATGTGGCTTCTT-3′

18S-rRNA-R1：5′-GCGTTCAAAAACTCGATGGT-3′

qRT-PCR操作參照張華奧等[22]的方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)錄入和作圖，應用SPSS 24軟件進行方差和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對菊花葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

如圖1所示，與對照組相比，隨著鹽處理時間的推移，F(xiàn)v/Fo、Fv/Fm和qP均有不同程度的降低。處理6 d以后，50、100、200 mmol/L處理組的Fv/Fo、Fv/Fm和qP與對照組均呈現(xiàn)顯著差異，處理9 d時，各處理組Fv/Fo較對照組分別下降19.0%、29.5%和40.7%，F(xiàn)v/Fm較對照組分別下降13.2%、26.0%和40.3%，qP較對照組分別下降11.0%、24.9%和40.4%；NPQ隨著處理時間的增加開始上升，同時處理濃度越大相應的上升幅度越大，各處理組在9 d時達到峰值，較對照組分別增加28.6%、44.0%和58.4%。

植物光系統(tǒng)對鹽逆境脅迫最敏感。鹽脅迫下菊花的光系統(tǒng)受到影響，NPQ呈現(xiàn)上升的趨勢，菊花的PSⅡ功能已經(jīng)受到影響。菊花通過提高熱散耗能力、減少激發(fā)能的產生保護自身光合系統(tǒng)不受損，提高抵御鹽脅迫的能力。鹽脅迫下，植物光合過程中電子傳遞和光合速率受到抑制，植株內活性氧大量積累，各種抗氧化酶活性發(fā)生變化。

2.2 鹽脅迫對菊花葉片抗氧化酶活性和MDA含量的影響

如圖2所示，與對照組相比，鹽處理后POD和CAT活性提高；處理9 d時，50、100、200 mmol/L處理組中POD活性較對照組分別增長94.6%、121.1%和258.9%，CAT活性較對照組分別增長88.0%、93.9%和137.6%。不同處理下SOD活性表現(xiàn)具有差異性，50 mmol/L和100 mmol/L處理組中，SOD活性明顯增大；200 mmol/L 處理組中SOD活性先上升后下降。各處理組菊花葉片MDA含量不斷上升，處理9 d時，各處理組較對照組分別增長了17.8%、58.5%、73.0%?？梢姡栈梢酝ㄟ^提高葉片內抗氧化酶的活性來適應外界的鹽脅迫環(huán)境，當鹽濃度過高時，膜脂過氧化產物MDA開始大量聚集，并表現(xiàn)顯著性提高。

同一時間下不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同

圖2 NaCl脅迫對菊花葉片抗氧化酶和MDA含量的影響Fig.2 Effects of NaCl stress on the contents of antioxidant enzymes and malondialdehyde in chrysanthemum leaves

2.3 鹽脅迫對菊花葉片可溶性物質及葉綠素含量的影響

由圖3A可知，隨著處理時間的增加，50 mmol/L處理組中可溶性糖含量不斷增加；100 mmol/L處理組先增加然后減少，處理6 d時較對照組增加115.3%，此時處于峰值，然后開始降低；200 mmol/L處理組呈不斷下降的趨勢，處理9 d時較對照組下降46.4%；圖3B中，可溶性蛋白含量在50、200 mmol/L處理組中先增加后減小，3 d時達到峰值，9 d時達到最低點，較對照組分別下降30.0%和48.9%；在100 mmol/L處理組中不斷下降，處理9 d時較對照組下降37.7%；由圖3C可知，50、100、200 mmol/L處理組中，脯氨酸含量不斷上升，處理9 d時，較對照組分別上升60.3%、73.9%和123.9%。由圖3D可知，處理0～6 d內，100 mmol/L處理組中葉綠素含量先下降后上升，6 d時葉綠素含量較對照組增加13.5%，9 d時葉綠素含量開始出現(xiàn)下降趨勢。

圖3 NaCl脅迫對菊花葉片可溶性物質和葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of NaCl stress on the contents of soluble matter and chlorophyll in chrysanthemum leaves

2.4 鹽脅迫對菊花葉片脂肪酸的影響

如表1所示，隨著處理時間的增加，處理組中棕櫚酸和硬脂酸含量逐漸下降；50、100 mmol/L處理組中亞麻酸和亞油酸含量不斷增加，處理9 d時，亞麻酸含量較對照組分別增長4.5%和25.6%，亞油酸含量分別增長21.7%和39.5%；50 mmol/L處理組中的油酸含量升高，6 d后趨于平穩(wěn)；100 mmol/L處理組中的油酸含量不斷增加，9 d時較對照組增加26.4%；200 mmol/L處理組中的油酸、亞油酸和亞麻酸3種物質的水平變化基本一致，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

如圖4所示，隨著處理時間的增加，處理組中飽和脂肪酸含量不斷下降；50、100 mmol/L處理組中不飽和脂肪酸含量不斷增加，9 d時，較對照組分別上升12.4%和31.4%；200 mmol/L處理組中不飽和脂肪酸先增加后減少，3 d時達到最大值，增幅為23.6%，9 d時下降18.3%。100 mmol/L和200 mmol/L處理組中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比率(USFA/SFA)逐漸增大，9 d時較對照組分別增長202.7%和195.9%；脂肪酸不飽和指數(shù)(IUFA)也呈現(xiàn)出不斷升高的趨勢，200 mmol/L處理組中IUFA先升高后降低，處理3 d時上升22.9%，達到峰值，隨后開始下降，9 d時較對照組下降16.4%。

以上結果說明低濃度鹽處理下，植物脂肪酸進行適應性調整，調節(jié)脂肪酸組分，增加不飽和脂肪酸的含量，增強細胞膜體系的穩(wěn)定性。鹽濃度過高時，受植物細胞內活性氧影響，不飽和脂肪酸被分解，細胞膜相發(fā)生改變。

2.5 鹽脅迫對菊花葉片脂肪酸去飽和酶關鍵基因表達量的影響

在課題組前期研究基礎上，選取CmSAD、CmFAD2以及CmFAD7三個脂肪酸去飽和酶關鍵基因進行分析。CmSAD在50 mmol/L和100 mmol/L處理組中的表達量不斷上升，9 d時分別達到對照組的2.8倍和8.2倍；200 mmol/L處理組中CmSAD的表達量先增加后減小，處理6 d時最高，是對照組的5.7倍，隨后開始降低(圖5A)。處理0 d時，CmFAD2的表達量隨著處理濃度的增加逐漸降低。隨著處理時間的延長，50 mmol/L和100 mmol/L處理組中基因表達量逐漸上升，處理9 d時分別達到對照組的1.3倍和1.9倍；200 mmol/L處理組中，3 d時數(shù)值最大，與對照組比較，是其1.4倍，6 d時表達量出現(xiàn)驟降，9 d時幾乎不表達(圖5B)。CmFAD7在50 mmol/L處理組中表達量不斷升高，9 d時是對照組的5.6倍；100 mmol/L和200 mmol/L處理組中的表達量均先升高后降低，100 mmol/L處理組在6 d達到峰值，是對照組的7.2倍，隨后開始降低，處理9 d時表達量只有對照組的59.0%；200 mmol/L處理組在3 d數(shù)值最高，是對照組的6.1倍，隨后開始下降，處理9 d時幾乎不表達(圖5C)。

表1 NaCl脅迫下菊花葉片脂肪酸組分及含量Tab.1 Fatty acid components in chrysanthemum leaves under NaCl stress %

注：同一時間下不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)；* 為同一濃度處理組下該類脂肪酸最大含量，**為同一濃度處理組下該類脂肪酸最低含量。

Note：There were significant differences between different lowercase letters at the same time(P<0.05)；*represents the maximum content of such fatty acids in the same concentration treatment group,** represents the lowest content of such fatty acids in the same concentration treatment group.

圖4 NaCl脅迫對菊花葉片脂肪酸含量的影響Fig.4 Effects of NaCl stress on the content of fatty acids in chrysanthemum leaves

結合脂肪酸組分變化分析可知，50、100 mmol/L處理組的基因表達量與葉片中不飽和脂肪酸含量變化均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，200 mmol/L處理組中CmFAD7的表達量與不飽和脂肪酸含量同時在6 d時下降，CmFAD2表達量的下降則出現(xiàn)在9 d時，較不飽和脂肪酸含量的下降有滯后性。

圖5 NaCl脅迫對菊花葉片脂肪酸去飽和酶基因表達量的影響Fig.5 Effects of NaCl stress on expression of fatty acid desaturase gene in chrysanthemum leaves

3 結論與討論

本試驗結果表明，鹽脅迫下，菊花葉片的qP、Fv/Fm和Fv/Fo不斷減小，NPQ不斷增大。鹽脅迫下菊花PSⅡ反應中心活性受到抑制，通過提高熱散耗能力、減少激發(fā)能產生以保護自身光合中心，提高自身抵御鹽脅迫的能力。在不同植物的試驗中均發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下Fv/Fm、Fv/Fo降低，PSⅡ中心活性受到影響[23-24]，與本試驗結果相似。

鹽濃度較低時，SOD、CAT、POD活性逐漸上升，高濃度下，SOD活性減小，MDA開始積累，此時植物的活性氧清除力開始下降。在脅迫濃度閾值內，活性氧清除系統(tǒng)能夠迅速反應，對菊花的各種代謝機構產生一定的保護作用，超出脅迫濃度閾值后，活性氧聚集，膜脂過氧化嚴重，MDA大量積累，對各種代謝機構產生影響。在鹽脅迫下，菊花葉中的可溶性糖、蛋白質和脯氨酸含量增大，用以增強植物細胞的保水能力；超出了菊花自身耐受能力后，細胞膜結構受損嚴重，可溶性糖、蛋白質和脯氨酸的合成能力受到影響，含量開始降低，細胞失水。AHMED等[25]在對橄欖樹幼苗的研究中指出，脯氨酸可以提高抗氧化酶活性，這一關系在菊花中有待進一步驗證。

本課題組前期試驗表明，菊花葉片總膜脂脂肪酸中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸5種占有率在95%以上[17]。隨著處理時間的增加，低濃度鹽處理下不飽和脂肪酸含量逐漸增加，膜的流動性得以保持；當脅迫濃度和時間超出菊花的耐受力時，不飽和脂肪酸含量減少，膜相發(fā)生改變。脂肪酸的去飽和途徑是不飽和脂肪酸合成的一個重要環(huán)節(jié)，CmSAD、CmFAD2、CmFAD7是不飽和脂肪酸合成中關鍵的限速酶基因。低濃度鹽處理下，不飽和脂肪酸以及CmSAD、CmFAD2、CmFAD7三個基因的表達量均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢；高濃度下，基因表達出現(xiàn)滯后性。這種滯后性可能是由于植物在鹽脅迫下膜結構受到損傷，導致基因表達與轉錄受到影響，也可能是光抑制過程中過量的活性氧引起不飽和脂肪酸含量下降所致。

本試驗結果表明，鹽脅迫下金絲皇菊通過抗氧化酶、滲透調節(jié)物質的改變以及脂肪酸去飽和基因的表達，保護光合系統(tǒng)的正常運轉，調節(jié)脂肪酸組分的變化以保護膜系統(tǒng)，提高自身抗鹽性。當脅迫程度超過自身的調節(jié)能力時，光合機構受到損傷，PSⅡ光合效率下降，活性氧大量積累對膜結構造成不可逆的傷害，導致不飽和脂肪酸含量與去飽和酶基因表達量下降。此外，還發(fā)現(xiàn)在100 mmol/L鹽脅迫處理中細胞內理化指標有明顯變化，在后期試驗中可以作為一個重要的參考指標。在接下來的研究中，將通過對比不同類型菊花的抗鹽性，為鹽堿地菊花種植提供科學依據(jù)。