王 雙，師麗紅，袁善奎，張 燕

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

1 引言

有效成分含量是決定微生物農(nóng)藥藥效的重要因素，目前,對于產(chǎn)孢微生物農(nóng)藥,一般采用技術(shù)成熟度較高的顯微計數(shù)法和平板菌落計數(shù)法進行檢測，而產(chǎn)品的前處理方式以及培養(yǎng)方式均對檢測結(jié)果具有重要影響，不同的檢測方式可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)較大的誤差。平板菌落計數(shù)法即將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取一定量的稀釋液涂布在平板上進行培養(yǎng)，這在一定程度上創(chuàng)造了含氧條件。兼性厭氧菌對氧氣有特殊要求，無氧和有氧條件下均能正常生長，但針對不同的兼性厭氧菌，不同供氧條件對該類微生物的含量檢測結(jié)果的影響研究較少。本研究選用4種兼性厭氧微生物農(nóng)藥[2～5]，在3種不同的培養(yǎng)基上對不同的培養(yǎng)方式進行含量檢測結(jié)果的研究和比較，找到適宜的微生物農(nóng)藥含量檢測方法，為準(zhǔn)確評價微生物農(nóng)藥的產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

2 材料和方法

2.1 供試藥劑 供試藥劑(表1)，其中包括2種水劑和2種可濕性粉劑。

表1 供試兼性厭氧微生物農(nóng)藥信息

2.2 培養(yǎng)基 對供試藥劑分別選用細(xì)菌培養(yǎng)常用營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基(表2)進行培養(yǎng)。此外，針對每種生物農(nóng)藥，還選用一種特殊培養(yǎng)基(表3)進行培養(yǎng)效果比較。

表2 培養(yǎng)基成分

*注：NA培養(yǎng)基為商業(yè)成品，購自北京金百環(huán)商貿(mào)有限責(zé)任公司。

表3 特殊培養(yǎng)基成分

2.3 培養(yǎng)方法 采取涂平皿法、平皿夾層法、倒平皿法分別對四種兼性厭氧微生物農(nóng)藥進行含量測定。試驗前在無菌條件下將藥劑稀釋到適宜濃度。

涂平皿法是將適宜濃度的稀釋液吸取100μL于培養(yǎng)基平板上，用曲玻棒均勻涂布在整個平板表面，放于最適宜培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。

平皿夾層法參考穆軍等分離純化厭氧細(xì)菌的方法。將10mL滅菌培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)，待冷卻后，將適宜濃度的稀釋液吸取100μL于培養(yǎng)基平板上，用曲玻棒均勻涂布在整個平板表面，涂布完成后將10mL 45℃左右的培養(yǎng)基再次倒入平皿內(nèi)，培養(yǎng)基凝固后置于適宜的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。

倒平皿法是將培養(yǎng)基加熱融化并冷卻至45℃，放在水浴鍋中保溫待用。將適宜濃度的稀釋液100μL放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)注入20 mL 45℃培養(yǎng)基，迅速用手搖動，使稀釋液與培養(yǎng)基充分混合攤布均勻，靜置凝固后放于適宜的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 用EXCEL軟件、SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，比較不同培養(yǎng)方法的顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同培養(yǎng)基對兼性厭氧微生物農(nóng)藥含量檢測的影響 四種兼性厭氧微生物農(nóng)藥分別選用3種培養(yǎng)基、3種培養(yǎng)方法培養(yǎng)，然后進行含量檢測。試驗結(jié)果表明，在同一培養(yǎng)方法、3種不同的培養(yǎng)基中，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌在NA培養(yǎng)基上的含量檢測結(jié)果均極顯著高于其他培養(yǎng)基(Duncan檢驗，P≤0.01)。多粘類芽孢桿菌采用涂平皿法和倒平皿法，NA培養(yǎng)基上的含量檢測結(jié)果也極顯著高于其他兩種培養(yǎng)基(Duncan檢驗，P≤0.01)，平皿夾層法中NA培養(yǎng)基與2號培養(yǎng)基無顯著差異(Duncan檢驗，P≤0.05)，而極顯著高于LB培養(yǎng)基檢測結(jié)果(Duncan檢驗，P≤0.01)。在對解淀粉芽孢桿菌進行含量檢測中發(fā)現(xiàn)，4號培養(yǎng)基的含量檢測結(jié)果極顯著高于NA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基(Duncan檢驗，P≤0.01)，而NA培養(yǎng)基的含量檢測結(jié)果也極顯著高于LB培養(yǎng)基(Duncan檢驗，P≤0.01)。

圖1 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌芽孢含量不同培養(yǎng)基測定結(jié)果

圖2 多粘類芽孢桿菌芽孢含量不同培養(yǎng)基測定結(jié)果

圖3 側(cè)孢短芽孢桿菌芽孢含量不同培養(yǎng)基測定結(jié)果

圖4 解淀粉芽孢桿菌芽孢含量不同培養(yǎng)基測定結(jié)果注：不同大小寫英文字母表示Duncan顯著性檢驗分別達(dá)到0.01、0.05水平。

因此，在所選用的培養(yǎng)基中，NA培養(yǎng)基是測定甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌的最佳選擇。而解淀粉芽孢桿菌的最適宜培養(yǎng)基為四號培養(yǎng)基。

3.2 不同培養(yǎng)方法對兼性厭氧生物農(nóng)藥含量檢測的影響 使用NA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌平皿夾層法和倒平皿法檢測結(jié)果無顯著差異(Duncan檢驗，P≤0.05)，但兩種培養(yǎng)方法的檢測結(jié)果均極顯著高于涂平皿法(Duncan檢驗，P≤0.01)。多粘類芽孢桿菌3種培養(yǎng)方法均表現(xiàn)出極顯著差異(Duncan檢驗，P≤0.01)，倒平皿法極顯著高于平皿夾層法(Duncan檢驗，P≤0.01)，平皿夾層法極顯著高于涂平皿法(Duncan檢驗，P≤0.01)。

使用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌3種培養(yǎng)方法均無顯著差異(Duncan檢驗，P≤0.05)。

使用特殊培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌3種培養(yǎng)方法無顯著差異(Duncan檢驗，P≤0.05)；多粘類芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌倒平皿法和平皿夾層法極顯著高于涂平皿法(Duncan檢驗，P≤0.01)；解淀粉芽孢桿菌倒平皿法極顯著高于平皿夾層法(Duncan檢驗，P≤0.01)，平皿夾層法極顯著高于涂平皿法(Duncan檢驗，P≤0.01)。

圖5 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌芽孢含量不同培養(yǎng)方法測定結(jié)果注：不同大小寫英文字母表示Duncan顯著性檢驗分別達(dá)到0.01、0.05水平。

3.3 各培養(yǎng)方式的變異系數(shù)分析 變異系數(shù)是指一組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差與其算術(shù)均數(shù)的比值或百分比，是反映某一總體各單位標(biāo)示值的差異程度、集中或離散狀況的常用統(tǒng)計量，一定程度上反映出試驗數(shù)據(jù)的可靠程度。在進行生物農(nóng)藥含量檢測時，變異系數(shù)也是需要考慮的指標(biāo)。本研究中，所有培養(yǎng)方法檢測結(jié)果的變異系數(shù)均<5%，其中涂平皿法的變異系數(shù)在1.94%～4.88%之間，平皿夾層法的變異系數(shù)在1.24%～4.89%之間，倒平皿法的變異系數(shù)在1.39%～4.99%之間(表4)。

表4 各培養(yǎng)方式的變異系數(shù)

(續(xù))

4 結(jié)論與討論

適宜的培養(yǎng)基是產(chǎn)孢細(xì)菌含量測定準(zhǔn)確可靠的關(guān)鍵因素之一，而對于兼性厭氧微生物，適宜的培養(yǎng)條件更在一定程度上影響含量檢測結(jié)果。本研究結(jié)果表明，針對甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌等3種兼性厭氧微生物農(nóng)藥，在選用的3種培養(yǎng)基中，NA為最適宜進行含量檢測的培養(yǎng)基種類，而解淀粉芽孢桿菌的含量檢測中推薦使用4號培養(yǎng)基。除培養(yǎng)基種類外，前處理方式、培養(yǎng)方法也會對含量檢測產(chǎn)生重要影響，在使用NA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和側(cè)孢短芽孢桿菌平皿夾層法和倒平皿法含量檢測結(jié)果極顯著高于涂平皿法(Duncan檢驗，P≤0.01)，多粘類芽孢桿菌倒平皿法檢測結(jié)果極顯著高于平皿夾層法和涂平皿法(Duncan檢驗，P≤0.01)。對于解淀粉芽孢桿菌，當(dāng)選用最佳培養(yǎng)基即4號培養(yǎng)基培養(yǎng)時倒平皿法檢測結(jié)果極顯著高于平皿夾層法和涂平皿法(Duncan檢驗，P≤0.01)。綜上所述，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和側(cè)孢短芽孢桿菌推薦在NA培養(yǎng)基上使用平皿夾層法或倒平皿法進行含量檢測，多粘類芽孢桿菌含量檢測推薦在NA培養(yǎng)基上使用倒平皿法，解淀粉芽孢桿菌推薦使用專用培養(yǎng)基即4號培養(yǎng)基進行倒平皿法檢測。

培養(yǎng)基中所含碳源、氮源是微生物正常生長不可或缺的營養(yǎng)成分。碳源在微生物生長代謝過程中不僅為細(xì)胞提供基本的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成，而且提供微生物生命活動中所需能源的原料[10]。氮源可以用來合成菌體生長代謝過程中的代謝中間產(chǎn)物，如核苷酸、氨基酸等，在進行微生物農(nóng)藥含量檢測中要選擇合適的碳源和氮源為微生物生長創(chuàng)造最佳條件。

本研究結(jié)果表明，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌含量檢測中最佳培養(yǎng)基均為NA。李潭[11]研究表明，復(fù)合氮源更有利于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的生長，曹紅等[12]對甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌最佳氮源篩選中發(fā)現(xiàn)，牛肉膏較胰蛋白胨更利于菌株生長。因此推測NA培養(yǎng)基中的復(fù)合氮源牛肉膏和蛋白胨是含量檢測結(jié)果較高的原因之一。檢測甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌所使用的1號培養(yǎng)基中含有可溶性淀粉和牛肉膏，雖然在含量檢測中該培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果顯著低于NA，但吳晶晶等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，以淀粉作為碳源、牛肉膏作為氮源可使甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵液中具有更強的纖維素酶活性，表明為達(dá)到不同的試驗?zāi)康膽?yīng)選用不同的培養(yǎng)基。馬桂珍等[14]在對解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)后，NA較LB具有更高的菌體密度。洪鵬等人[15]研究也發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)中最佳碳源和氮源分別是葡萄糖和酵母粉，這與4號培養(yǎng)基的成分相一致。

兼性厭氧微生物由于其特殊性，在好氧和厭氧條件下均能正常生長，在本研究中選用的四種兼性厭氧微生物農(nóng)藥中，平皿夾層法和倒平皿法均較涂平皿法檢測結(jié)果高，表明厭氧條件更有利于對兼性厭氧微生物農(nóng)藥進行含量檢測。