劉 球 ，吳際友 ，楊碩知 ，梁文斌 ，李志輝 ，程 勇

（1.湖南省林業(yè)科學院，湖南 長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004）

在全球氣候大背景下，植物正面臨著各種各樣的生存挑戰(zhàn)。在植物遭受的環(huán)境脅迫中，干旱脅迫屬于比較常見的一種。在整個生命周期中，植物經(jīng)常會遭遇水分虧缺[1]。

葉片被視為高等植物光合作用的活動中心，也是植物在環(huán)境中暴露面積最大的器官。植物在遭遇干旱脅迫時，葉片的表型、解剖結構、生理等性狀均能及時響應[2-3]。葉片各具體響應，與該植物的抗旱能力直接相關[4]。楊小玉[5]在研究5種灌木葉片解剖結構時發(fā)現(xiàn)，楊柴、沙柳和蒙古蕕的角質層和表皮細胞壁均在干旱環(huán)境下有明顯加厚。潘存娥等[6]對5種楊樹無性系的干旱脅迫響應進行研究發(fā)現(xiàn)各無性系葉片上表皮細胞排列緊密，厚度在11.03～ 17.44 μm，下表皮厚度在7.75～12.79 μm。王順才等[7]觀測發(fā)現(xiàn)不同蘋果葉片角質層對水分虧缺的響應差異明顯，這也是不同蘋果屬植物擁有不同抗旱能力的原因之一。一般在處于水分虧缺狀態(tài)時，樹木葉片柵欄組織發(fā)達、細胞層數(shù)增加且體積減小，但海綿組織相對減少、細胞間隙也減小[8]。隨著水分虧缺的嚴重，柵/海比值會逐漸增大，葉片緊密程度不斷提高，表示植株抗旱能力在增強[9]。李鴻雁等[10]對6種牧草葉片進行觀測比較得出，各參試材料的柵欄組織和海綿組織種間差異極顯著，且柵/海比值均大于1。吳建慧等[11]發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫程度加重，絹毛委陵菜葉片柵欄組織、海綿組織均變薄，柵/海比值大于對照。翟曉巧等[12]對8種落葉喬木的葉片解剖結構研究，得知各樹種葉片都具有角質膜，但厚度差別很大。潘學軍等[13]對喀斯特山區(qū)野生葡萄的葉片解剖結構與抗旱性的關系進行了研究發(fā)現(xiàn)，4種野生葡萄葉片厚度存在明顯差異。王丹等[14]發(fā)現(xiàn)，在水分脅迫下，亮葉忍冬和蔓生紫薇葉片厚度均極顯著變薄。郭改改等[15]對不同區(qū)域長柄扁桃葉片解剖結構分析發(fā)現(xiàn)，榆陽區(qū)長柄扁桃抗旱性最強，其葉片維管組織發(fā)達，含較多貯水細胞。馬小芬等[16]對文冠果葉片進行解剖發(fā)現(xiàn)其具有明顯的旱生植物特點，葉片表皮有較厚的角質層和細胞壁，輸導組織發(fā)達。劉紅茹等[17]對延安5種木犀科園林植物進行葉片解剖結構觀察發(fā)現(xiàn)，中脈均比較發(fā)達，厚度分布在560.9～978.5 μm，其中以白蠟的中脈最厚。在干旱條件下，植物葉片氣孔密度越大，越有利于植物短時間內充分利用有效水分進行光合作用[18]。許多旱生植物在干旱時為了節(jié)約體內水分，會使葉表皮氣孔下陷、加大密度或縮小孔徑，以此對干旱環(huán)境做出快速響應[19]。韓永芬等[20]研究表明，下表皮氣孔長度和密度以及上表皮氣孔長度是評價菊苣抗旱性的敏感指標。張誠誠等[21]發(fā)現(xiàn)，油茶容器苗的氣孔面積、密度、大小及開度隨著基質含水量的減少有顯著變化，基質含水量為81%～90%時，氣孔面積和密度都較大，而氣孔開度和大小均較小。

紅椿Toona ciliata，是我國優(yōu)先重點發(fā)展的鄉(xiāng)土珍貴樹種之一，作為優(yōu)良的家居裝飾用材樹種，市場前景非常廣闊。本研究團隊對紅椿的水分生理以及外源調節(jié)方面做了多年的工作，在紅椿抗旱[22-25]特性、紅椿抗水淹[26]特性、外源調節(jié)抗旱能力[27]等方面展開了深入系統(tǒng)的研究，掌握了紅椿的水分生理特性以及相關的有效抗旱調節(jié)措施。本文是從植株葉片解剖結構的角度入手，探討葉面噴施外源多胺對干旱脅迫下紅椿幼苗葉片的解剖結構損傷的修復效果，為紅椿苗圃抗旱實踐提供科學依據(jù)和技術指導，為完善外源多胺調節(jié)紅椿抗旱能力的系統(tǒng)研究提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地設在湖南省林業(yè)科學院苗圃，海拔為110 m，地理坐標為 112°59′E、28°05′N，年平均氣溫16.8 ℃，年降水量1 400～1 900 mm，平均日照時數(shù)1 496～1 850 h，無霜期達264 d，屬于中亞熱帶季風濕潤氣候區(qū)，雨量豐沛，光照充足；土壤為紅壤，土層厚達60 cm以上，肥力中等，pH值為6.2[22]。

1.2 材料與方法

本試驗材料為2年生紅椿家系盆栽苗。2012年3月，課題組開展田間育苗。2014年3月，選擇苗高1.0 m、胸徑1.8 cm的長勢均勻、無病蟲害的健康紅椿幼苗裝盆，盆缽口徑25 cm、深20 cm，每盆裝土5 kg，比例為黃心土∶泥炭土=2∶1，統(tǒng)一配盆墊，進行正常澆水管護。2014年6—7月，在入盆植株中篩選出長勢均勻的紅椿幼苗進行干旱脅迫及外源多胺修復試驗[22]。

1.3 試驗設計

本試驗為“干旱脅迫+多胺修復處理”試驗，采用完全隨機設計，包括對照（無干旱脅迫、不噴施多胺）、干旱脅迫（1種）和多胺修復處理（3種）。植株干旱脅迫設置1種梯度，即持續(xù)干旱21 d （土壤相對含水率20%～25%）；噴施多胺修復處理有3種，即外源腐胺（Putrescine，簡稱Put）、外源亞精胺（Spermidine，簡稱Spd）、外源精胺（Spermine，簡稱Spm），先對參試植株進行重度干旱脅迫，然后再對其進行多胺修復處理并采樣分析。多胺修復處理，即干旱結束日起，每天傍晚18:00對干旱脅迫對象噴施濃度為1 mmol·L-1的外源Put、Spd和Spm水溶液，貼近植株葉片正反面進行霧狀噴施，噴施量以葉片正反面水珠凝結滴落為限，連續(xù)噴施3 d。對照植株并未參與干旱脅迫以及多胺修復處理，試驗過程中需對其進行日常管護。每種多胺處理5株，重復3次，共4個多胺修復處理（含對照），一共處理60株。

1.4 指標測定方法

分別在干旱前、干旱后和多胺修復處理后第2天9:00前對葉片進行采樣時，統(tǒng)一選擇第三輪或第四輪成熟葉片。葉片解剖結構觀測參照李正理等[28]的常規(guī)石蠟切片法。取出采集的葉片，用鋒利的刀片切去葉片的上下各三分之一，然后將剩余中部三分之一葉片沿著主脈橫切成大小約為1.0 cm×0.5 cm的小方塊，在完成抽氣后，將方塊放進福爾馬林、醋酸和酒精配置的FAA固定液中進行固定。制作切片的厚度為8～10 μm，用番紅-固綠進行雙重染色，然后用中性樹膠完成封片。切片的解剖結構特征是采用Motic BA410顯微鏡進行觀測，隨后進行拍照，記錄圖片信息，并用顯微測微尺測定葉片主脈直徑、上表皮厚度、下表皮厚度、葉肉厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度，每個指標數(shù)值均由25個觀測視野計算平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2003 進行處理，用SPSS 17.0進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片主脈直徑的修復效果

2.1.1 干旱修復處理后的紅椿葉片主脈直徑

在對照、干旱脅迫和外源多胺（Put、Spd和Spm）修復調節(jié)處理之間，紅椿葉片主脈直徑均在α=0.01水平差異顯著（圖1）。干旱脅迫后，紅椿葉片主脈直徑……；在遭受干旱脅迫并噴施外源Put修復調節(jié)后，葉片主脈直徑恢復并超出干旱脅迫狀態(tài)下指標值的55.63%；在遭受干旱脅迫并噴施外源Spm修復調節(jié)后，葉片主脈直徑恢復并超出干旱脅迫狀態(tài)的95.67%；但在遭受干旱脅迫后，如果噴施外源Spd修復調節(jié)，則主脈厚度反而變薄，變薄幅度為干旱脅迫狀態(tài)的53.26%。

圖1 紅椿干旱脅迫及外源多胺修復處理后的葉片主脈直徑Fig.1 Effects of drought stress and exogenous polyamine treatments on main vein diameter of of T.ciliate seedling leaves

2.1.2 不同外源多胺對紅椿干旱脅迫下主脈厚度的修復效果比較

葉片主脈的大小跟水分在植物體內的運輸效率直接相關。主脈越粗，植株葉片水分運輸效率則越高，抵御干旱失水傷害的能力也就越強。因此，主脈厚度變化值（主脈厚度變化值=試劑調節(jié)后主脈厚度-干旱脅迫處理下主脈厚度）越大，表示外源多胺的修復調節(jié)效果越好。結果顯示，3種多胺溶液對紅椿葉片主脈直徑的修復調節(jié)效果在α=0.01水平差異顯著。外源Put和外源Spm對主脈厚度的修復調節(jié)起到的是正向作用，而外源Spd則起到的是負向作用，說明對植株的水分運輸能力的修復效果來講，以Spm效果最佳。

2.2 葉面噴施外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片厚度的修復效果

2.2.1 葉面噴施外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片上表皮厚度的修復效果

2.2.1.1 干旱修復處理后的紅椿葉片上表皮厚度

在對照、干旱脅迫和外源多胺（Put、Spd和Spm）修復調節(jié)處理之間，紅椿葉片上表皮厚度均在α=0.05水平差異顯著。如圖2所示，噴施外源Put對葉片上表皮厚度的增厚效果不顯著；但噴施外源Spd修復調節(jié)后葉片上表皮厚度顯著增加，增加幅度為干旱脅迫狀態(tài)的13.14%；噴施外源Spm對上表皮厚度增厚效果也未達到顯著性水平。

2.2.1.2 不同外源多胺對紅椿干旱脅迫下上表皮厚度的修復效果比較分析

圖2 外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片上表皮厚度的修復調節(jié)Fig.2 Effects of drought stress and exogenous polyamine treatments on upper epidermis thickness of T.ciliate seedling leaves

植物葉片上表皮厚度是植物葉片厚度的一個重要指標。植物葉片越厚，儲水能力就越強。如果外源多胺的修復調節(jié)能夠增加葉片上表皮厚度，則表示有助于提高葉片的儲水能力，從而提高其抵抗干旱脅迫的潛力。因此，上表皮厚度變化值（上表皮厚度變化值=試劑調節(jié)后上表皮厚度-干旱脅迫處理下上表皮厚度）越大，表示外源多胺對葉片儲水能力起到了修復效果越大。統(tǒng)計結果顯示，3種多胺溶液均能對紅椿葉片上表皮厚度起到調節(jié)效果，但三者之間差異不明顯。然而，各種外源多胺對干旱脅迫下上表皮厚度調節(jié)效果以Spd效果最佳。

2.2.2 葉面噴施外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片下表皮厚度的修復效果

2.2.2.1 干旱修復處理后的紅椿葉片下表皮厚度

在對照、干旱脅迫和外源多胺（Put、Spd和Spm）修復調節(jié)處理之間，紅椿葉片下表皮厚度均在α=0.01水平差異顯著（圖3）。下表皮厚度在遭受干旱脅迫后顯著變小，噴施外源Put修復調節(jié)后，下表皮厚度在干旱脅迫基礎變化并不顯著；但噴施外源Spd對下表皮厚度的修復調節(jié)效果很顯著，增加幅度為干旱脅迫狀態(tài)的9.60%；噴施外源Spm對下表皮厚度的修復調節(jié)效果也非常顯著，增厚幅度為干旱脅迫狀態(tài)的29.09%。

2.2.2.2 不同外源多胺對紅椿干旱脅迫下下表皮厚度的修復效果比較

同上表皮厚度一樣，植物葉片下表皮厚度也是植物葉片厚度的一個重要指標。如果外源多胺的修復調節(jié)能夠增加葉片下表皮厚度，則表示調節(jié)有助于提高葉片的儲水能力，從而提高其抵抗干旱脅迫的潛力。因此，下表皮厚度變化值（下表皮厚度變化值=試劑調節(jié)后下表皮厚度-干旱脅迫處理下下表皮厚度）越大，表示外源多胺對葉片儲水能力起到修復效果越大。從圖3中可看出，外源Spd和Spm對下表皮厚度的修復調節(jié)起到了不同程度的正向作用，其中Spm效果更佳。2.2.3 葉面噴施外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片葉肉厚度的修復效果

圖3 外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片下表皮厚度的修復調節(jié)Fig.3 Effects of drought stress and exogenous polyamine treatments on lower epidermis thickness of T.ciliate seedling leaves

在對照、干旱脅迫和外源多胺（Put、Spd和Spm）修復調節(jié)處理之間，紅椿葉片葉肉組織厚度均在α=0.01水平差異顯著（圖4）。噴施外源Put對葉肉組織厚度的修復效果不明顯；但噴施外源Spd對葉肉組織厚度的修復調節(jié)效果非常明顯，厚度比干旱脅迫下明顯回升21.78%；葉肉組織厚度在遭受干旱脅迫后顯著變小，然而噴施外源Spm起到了負向作用，厚度繼續(xù)明顯減小，減小幅度為干旱脅迫下數(shù)值的9.01%。

圖4 外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片葉肉組織厚度的修復調節(jié)Fig.4 Effects of drought stress and exogenous polyamine treatments on mesophyll tissue thickness of T.ciliate seedling leaves

葉肉厚度是植物葉片厚度的重要組成部分，葉肉厚度越大，則植物儲水保水能力越強，抵抗干旱失水的時間越持久。如果外源多胺的修復調節(jié)能夠增加葉片葉肉厚度，則表示調節(jié)有助于提高葉片的儲水能力。因此，葉肉厚度變化值（葉肉組織厚度變化值=試劑調節(jié)后葉肉組織厚度-干旱脅迫處理下葉肉組織厚度）越大，表示外源多胺對葉片儲水能力起到了修復效果越大。結果顯示，3種外源多胺溶液均能對紅椿葉片葉肉厚度修復調節(jié)效果在α=0.01水平差異顯著。從圖中可看出，外源Spd、Put對葉片葉肉厚度的調節(jié)起到了不同程度的正向作用，而且Spd效果最佳。

結合葉片上表皮厚度、下表皮厚度和葉肉組織厚度3個指標響應的綜合情況來看，3種外源多胺對紅椿葉片干旱脅迫后的持水保水能力有不同程度的修復作用，而且可以得知，以外源Spd對紅椿葉片干旱脅迫后的持水保水能力的修復效果最強。

2.3 葉面噴施外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片柵/海比值的修復效果

2.3.1 干旱修復處理后的紅椿葉片柵/海比值

在對照、干旱脅迫和外源多胺（Put、Spd和Spm）修復調節(jié)處理之間，紅椿葉片柵/海比值均在α=0.01水平差異顯著。葉片柵/海比值在遭受干旱脅迫后顯著提高，噴施外源Put后，比值在干旱脅迫基礎繼續(xù)明顯提高，提高幅度為干旱脅迫基礎上的16.99%；柵/海比值在遭受干旱脅迫后顯著提高，但噴施外源Spd修復調節(jié)后比值明顯減小25.17%，然而仍未回到對照水平；柵/海比值在遭受干旱脅迫后顯著提升，噴施外源Spm后比值繼續(xù)明顯提高，在干旱脅迫基礎上提高幅度為24.26%。

圖5 外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片柵欄組織厚度/海綿組織厚度的修復調節(jié)Fig.5 Effects of drought stress and exogenous polyamine treatments on ratio of palisade tissue thickness to spongy tissue thickness of T.ciliate seedling leaves

2.3.2 不同外源多胺對紅椿干旱脅迫下柵/海比值的修復效果比較

許多研究發(fā)現(xiàn)，隨著植株遭受干旱脅迫程度的加劇，柵/海比值會有所升高，葉片緊密度也會有所提高，原因是在干旱脅迫下，植株的柵欄組織和海綿組織會分化成適應脅迫狀態(tài)、保證光合作用的形式，一般是柵欄組織變厚，海綿組織變少。然而，在干旱脅迫得到修復的情況下，由于植株的脅迫威脅得到減輕或解除，植株的干旱適應響應情況也會有所改變，植株的柵/海比值也將會有所下降。如果外源多胺能夠改善植株的干旱脅迫受害情況，那么柵/海比值也會比脅迫狀態(tài)時有所下降。因此，柵/海比值變化值（柵/海變化值=試劑調節(jié)后柵/海比值-干旱脅迫處理下柵/海比值）越小，表明外源多胺對其的修復調節(jié)效果越好。本實驗中，3種多胺溶液均能對紅椿葉片柵/海比值的修復調節(jié)效果在α=0.01水平差異顯著。從圖5中可看出，僅外源Spd調節(jié)后對該比值變化值為負，也就是說外源Spd對植株脅迫狀態(tài)的緩解調節(jié)起到了明顯的積極作用。

3 討 論

3.1 外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片水分運輸能力的修復作用

植物葉脈對干旱脅迫主要有兩個方面的適應表現(xiàn)，一是具有比較密集的維管束，維管組織發(fā)達，以增強植物的水分疏導能力和支撐能力；另一方面是增加葉片主脈直徑、導管直徑及密度，提高水分疏導能力，從而提高植物對干旱的適應和抵御能力[29]。葉片主脈的大小跟植物體內的水分運輸效率直接相關。越粗的主脈具有越強的水分控制能力，可在高溫及干旱條件下加快蒸騰，降低葉面溫度，避免植物體受高溫干旱傷害。另外，主脈中的含晶細胞和維管束鞘也可降低植物蒸騰[30]。本實驗中，不同外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片主脈直徑的修復效果是不同的，外源Spm對主脈厚度的修復調節(jié)作用最佳，其次是外源Put。說明外源Spm和外源Put調節(jié)處理后，紅椿葉片主脈直徑因干旱脅迫所受損傷在一定程度上得到了緩解和修復，進而恢復水分疏導能力，舒緩脅迫癥狀。

3.2 外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片水分儲存能力的修復作用

表皮毛、表皮、表皮覆蓋物及氣孔屬于植物的保護組織，其主要作用和功能是減少蒸騰、防止水分流失，是植物儲水能力的體現(xiàn)[31]。植物角質層是在植物表面覆蓋的、由脂肪酸及其衍生物構成的疏水性物質，主要由角質和蠟質組成。角質層的蠟質沉積或嵌入角質基質中，可限制植物表面水分的非氣孔性散失，并保護植物內部組織免受紫外線輻射及病菌浸染[32]。本實驗中測定了葉片的上表皮厚度、下表皮厚度以及葉肉組織厚度，3個指標值相加表示植物葉片的厚度。植物葉片越厚，其儲水能力就越強，越有利于防止水分過分蒸騰[33]。因此，葉片厚度通常被視為衡量植物抗旱能力的一個重要指標[34]。綜合3個指標對3種外源多胺的響應情況，3種外源多胺對干旱脅迫后紅椿葉片的儲水能力均有不同程度的修復作用，以外源Spd效果最佳，說明外源Spd可通過修復紅椿葉片的儲水能力進而提高植株的抗旱性能，降低缺水對植株產(chǎn)生的傷害。

3.3 外源多胺對干旱脅迫下紅椿葉片柵欄組織、海綿組織的比例結構的修復作用

植物柵欄組織和海綿組織的分化情況可間接體現(xiàn)環(huán)境中的水分狀態(tài)。一般處于水分虧缺狀態(tài)時，樹木葉片柵欄組織發(fā)達、細胞層數(shù)增加并且體積減小，但海綿組織卻相對減少、細胞間隙也減小[35]。樹木葉片柵欄組織越發(fā)達表示其抗旱能力越高[36]。柵欄組織高度發(fā)達，可避免植物葉肉細胞受強光灼傷的同時，充分利用衍射光進行光合作用[37]。即柵欄組織越厚，細胞越小，排列越緊密，植物的光能利用率越高。隨著水分含量減少，柵/海比值會逐漸增大，葉片的緊密程度會不斷提高。然而，在干旱脅迫得到修復的情況下，植株的柵/海比值會有所下降。本實驗中，外源多胺對紅椿的干旱脅迫損傷起到了類似的修復效果，其中外源Spd對紅椿葉片干旱脅迫狀態(tài)的緩解起到了明顯的積極作用。

4 結 論

本研究采用了“對照-干旱-多胺修復”縱向分析的角度，運用精確的指標變化值，對不同多胺修復處理之于干旱脅迫的影響差異進行分析和比較，試驗結果具有很高的可行性和可靠性。在外源Put、Spd和Spm3種不同的多胺修復處理下，我們可以得知，外源Spd和Spm對紅椿植株干旱修復起到了不同方面的積極響應，但外源Put修復效果不顯著。對植株的水分運輸能力而言，以外源Spm溶液的修復效果最佳；對植株持水保水能力而言，以外源Spd修復效果最強；而在紅椿葉片柵欄組織、海綿組織比例結構的緩解調節(jié)方面，僅外源Spd溶液起到了明顯的積極作用。

綜上所述可知，在紅椿苗期干旱修復措施方面，葉面噴施1 mmol/L的外源Spd或Spm溶液均能起到有效的調節(jié)效果，可在嚴密觀測初試效果后，結合生產(chǎn)成本等多方面因素，酌情考慮是否可以用于苗圃實踐。