李 恩，葉 魁，孫君志，蘇全生

胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是機體細胞無法對胰島素產(chǎn)生正常反應(yīng)的一種病理狀態(tài)。骨骼肌是胰島素抵抗發(fā)生的主要部位之一[1]。細胞自噬，又稱“自體吞噬”，作為一種溶酶體依賴性降解途徑廣泛存在于真核生物內(nèi)。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞器出現(xiàn)衰老、損傷或變形時，細胞自噬被激活，自噬小體將其包裹吞噬并轉(zhuǎn)運至溶酶體進行消化降解。因而，適宜的自噬水平對于維持骨骼肌形態(tài)完整性非常重要[2]。

胰島素抵抗與細胞自噬密切相關(guān)。已有大量研究指出，長時間高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠骨骼肌mTORC1活性顯著升高，細胞自噬水平明顯下降[3-5]。運動可明顯改變骨骼肌細胞自噬狀態(tài)[6]。Yan等發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠進行28天自主轉(zhuǎn)輪運動后，趾肌中細胞自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1、LC3-II和LC3-II/LC3-I分別增加了33%、43%和21%[7]，許多研究發(fā)現(xiàn)2～7天耐力運動可使骨骼肌細胞自噬活性程度出現(xiàn)明顯升高[8-9]。但尚未查到運動對胰島素抵抗骨骼肌細胞自噬影響的相關(guān)報道。以高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模型為研究對象，觀察骨骼肌細胞的自噬情況和有氧運動干預(yù)對骨骼肌細胞自噬的影響，旨在為骨骼肌胰島素抵抗的運動治療提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

雄性Sprague-Dawley大鼠36只(6周齡，體重200±30 g，SPF級)，購于成都達碩生物科技有限公司(生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-30，合格證號：0000650)。飼養(yǎng)于成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)與健康研究所動物房。室內(nèi)溫度控制在22～25℃，相對濕度40% ～70%，自然光照。用窗簾和燈光控制12：12h明暗循環(huán)，通風(fēng)良好。

1.2 造模及分組

1.2.1 動物分組與胰島素抵抗模型建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，用SPSS 17.0將雄性SD大鼠36只隨機分為3組：正常飲食組(Normal Diet Group，ND， n=8)、高脂飲食組(High Fat Diet Group，HFD，n=12)和高脂飲食 +運動組(High Fat Diet+Exercise group， HFD+EXE， n=16)。

HFD和HFD+EXE組給予高脂飲食(普通飼料71.8%，豬油18%，膽固醇2%，蛋黃粉8%，膽酸鈉0.2%)飼養(yǎng)，8周后取血檢測空腹血糖、血清胰島素和胰島素抵抗指數(shù)判斷胰島素抵抗模型的建立；ND組正常飲食喂養(yǎng)。

1.2.2 運動方案

HFD+EXE組在實驗前先進行3天適應(yīng)性游泳練習(xí)。正式運動干預(yù)時，以無負重游泳15 min開始，每天遞增10～20 min，經(jīng)過1周增加至60 min，此后維持此運動量直至實驗結(jié)束，每周運動6天。大鼠游泳池規(guī)格：150 cm×60 cm×70 cm，水溫為30±2℃。必要時驅(qū)趕不游泳的大鼠以防其靜止漂浮。

1.3 樣本采集與指標(biāo)檢測

1.3.1 樣本采集

禁食12小時后，2%戊巴比妥鈉溶液2.3 ml/kg腹腔注射麻醉，新潔爾滅消毒皮膚，以腹部正中切口打開腹腔，腹主動脈取血，離心血清備用；取腓腸肌置于4℃生理鹽水中反復(fù)漂洗后，濾紙吸干水分，部分組織置于3%戊二醛固定液中固定用于透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察；部分組織經(jīng)液氮急凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。

1.3.2 空腹血糖測試

大鼠禁食12 h后，尾靜脈取血，采用強生穩(wěn)豪型血糖儀測量空腹血糖。

1.3.3 血清胰島素測定

禁食12 h，尾部靜脈取血后，離心分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(96孔，Millipore，USA)檢測。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行，酶標(biāo)儀(Bio-Tek，USA)450 nm波長依序測試各孔的吸光度(0D值)。

1.3.4 HOMA-IR指數(shù)的計算

胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis Model Assessment-IR Index，HOMA-IR)用于判斷胰島素抵抗水平變化。HOMA-IR指數(shù)越高，胰島素抵抗程度越嚴(yán)重。HOMA-IR指數(shù)=FBG*FINS/22.5。

1.3.5 骨骼肌超微結(jié)構(gòu)檢測

每組選取3只大鼠同側(cè)腓腸肌，用3%戊二醛固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮酸逐級脫水，環(huán)氧樹脂812包埋，半薄切片光學(xué)定位，然后制成超薄切片，醋酸軸及枸櫞酸鉛雙重染色，日立H-600IV型透射電鏡觀察并拍照。

1.3.6 蛋白免疫印跡

適量腓腸肌樣品置于預(yù)冷的組織裂解液(Lysis Buffer)中勻漿，冰上放置1 h使組織充分裂解，4°C，13 000 rpm離心1h后取上清，BCA法定量蛋白。樣品經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉、孵育一抗(LC3-II，LC3-I， Beclin-1；abcam， USA)、孵育二抗、ECL 法顯影和曝光。Image-J圖像分析軟件進行條帶灰度分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 實驗結(jié)果

2.1 各組大鼠的基本情況

ND組大鼠精神狀態(tài)較好，進食與飲水正常，皮毛光澤且活潑好動；HFD組大鼠隨著高脂飲食的時間增長，精神狀態(tài)不佳，反應(yīng)遲鈍、皮毛粗糙和蠟黃，多出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，尿量較ND組增多，大便稀薄，且在實驗過程中有4只大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重感染(其中2只死亡)；HFD+EXE組大鼠精神狀態(tài)、反應(yīng)速度、皮毛和二便情況與HFD組相比均有所改善，其中，造模過程中，3只大鼠嚴(yán)重感染死亡，游泳運動干預(yù)過程中有3只溺亡，2只未按預(yù)定運動方案完成全部運動干預(yù)被剔除。

排除試驗過程中感染死亡和未完成既定運動干預(yù)方案的大鼠后，ND、HFD和HFD+EXE組大鼠樣本量均為8只。

2.2 各組大鼠體重、FBG、FINS和HOMA-IR指數(shù)的變化

正式實驗開始時，各組大鼠體重?zé)o明顯差異(P＞0.05)。高脂飼料喂養(yǎng)8周，與 ND組相比，HFD和HFD+EXE組大鼠體重明顯升高(P＜0.05)。8周游泳運動干預(yù)后，HFD+EXE組大鼠體重較HFD組顯著性降低(P＜0.05)(圖1A)。

與ND組比較，HFD組大鼠FBG和HOMA-IR均明顯升高(P＜0.05)；FINS非常顯著性下降(P＜0.01)；而與HFD組相比，HFD+EXE組大鼠FBG和HOMA-IR出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05)，F(xiàn)INS顯著上升(P ＜0.05)(圖1B、C、D)。

圖1 各組大鼠體重、空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的變化(*P＜0.05，**P＜0.01)A各組大鼠體重的變化情況；B各組大鼠空腹血糖的變化情況；C各組大鼠空腹胰島素的變化情況；D各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)的變化情況。Figure 1 The difference of Body weight(BW)，F(xiàn)asting Blood Glucose(FBG)，F(xiàn)asting Insulin(FINS)and HOMA-IR among the Normal Diet group(ND)，High Fat Diet group(HFD)and High Fat Diet+Exercise group(HFD+EXE)(*P＜0.05，**P＜0.01)A The changes of body weight after 8 weeks aerobic exercise training， B The changes of fasting blood glucose after 8 weeks aerobic exercise training， C The changes of fasting insulin after 8 weeks aerobic exercise training， D The changes of HOMA-IR after 8 weeks aerobic exercise training.

2.3 各組大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化

ND組肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰；HFD組肌纖維排列較整齊，結(jié)構(gòu)較清晰，線粒體出現(xiàn)明顯損傷，部分線粒體可見空泡變性；HFD+EXE組肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，胞漿內(nèi)線粒體輕度損傷。但各組均未發(fā)現(xiàn)自噬小體(圖2)。

2.4 各組大鼠 LC3-II、LC3-I、LC3II/LC31 和 Beclin-1表達的變化

與ND組相比，HFD和 HFD+EXE組大鼠LC3-I未發(fā)生明顯變化(P ＞0.05)，LC3-II、LC3-II/LC3-I和Becline-1蛋白表達非常顯著性下降(P＜0.01)；與 HFD組相比，HFD+EXE組LC3-II/LC3-I和 Becline-1明顯升高(P＜0.05)，且LC3-II蛋白非常顯著性增加(P＜0.01)(圖3)。

圖2 各組大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化情況(×10 000)Figure 2 The ultrastructure changes of skeletal muscle in rats in the Normal Diet group(ND)，High Fat Diet group(HFD)and High Fat Diet+Exercise group(HFD +EXE)(×10 000)

圖3 各組大鼠骨骼肌 LC3-II、LC3-I、LC3-II/LC3-I和Becline-1的蛋白表達變化(*P＜0.05，**P＜0.01)A各組大鼠骨骼肌LC3-I蛋白表達變化情況；B各組大鼠骨骼肌LC3-II蛋白表達變化情況；C各組大鼠骨骼肌LC3-II/LC3-I變化情況；D各組大鼠骨骼肌Becline-1蛋白表達變化情況Figure 3 The difference of LC3-II， LC3-I， LC3-II/LC3-I and Becline-1 among the Normal Diet group(ND)，High Fat Diet group(HFD)and High Fat Diet+Exercise group(HFD+EXE)(*P＜0.05，**P＜0.01)A The protein expression levels of LC3-II in gastrocnemius after 8 weeks aerobic exercise training，B The protein expression levels of LC3-I in gastrocnemius after 8 weeks aerobic exercise training，C The changes of LC3-II/LC3-I in gastrocnemius after 8 weeks aerobic exercise training，D The protein expression levels of Becline-1 in gastrocnemius after 8 weeks aerobic exercise training.

3 討論

3.1 有氧運動對IR大鼠血糖代謝和胰島素抵抗的影響

目前，胰島素抵抗的非藥物治療手段主要采用飲食控制和運動干預(yù)。運動可明顯減緩胰島素抵抗已有大量研究報道。齊潔等對高脂飼料誘導(dǎo)的胰島素抵抗SD大鼠進行為期8周的游泳運動干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，無論是每天連續(xù)訓(xùn)練90 min還是上午與下午各訓(xùn)練45 min都能明顯降低胰島素抵抗，且二者之間無顯著性差異[10]。同時，許國喜等也指出，有氧運動可明顯提高胰島素抵抗大鼠骨骼肌IRS-1表達，且IRS-1磷酸化水平也明顯升高，胰島素抵抗現(xiàn)象明顯改善[11]。人體試驗方面，劉鷗等發(fā)現(xiàn)，有氧運動能夠明顯改善肥胖患者的HOMA-IR指數(shù)水平，并在一定程度上保護患者的胰島β細胞功能[12]。本實驗中，SD大鼠經(jīng)8周高脂飲食喂養(yǎng)后出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗現(xiàn)象，8周游泳運動可明顯降低胰島素抵抗大鼠空腹血糖，且使胰島素抵抗指數(shù)顯著下降，進而明顯改善骨骼肌胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，和先前研究結(jié)果一致。

3.2 有氧運動對IR大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的影響

電子顯微鏡檢測是當(dāng)今觀察細胞自噬形態(tài)學(xué)變化最直接、最經(jīng)典的方法。Antonio等指出，用于檢測細胞自噬時，電子顯微鏡可觀察到細胞器的損傷情況、損傷細胞器周圍出現(xiàn)的空泡狀雙層膜結(jié)構(gòu)及后續(xù)形成的自噬體結(jié)構(gòu)[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動干預(yù)后，小鼠骨骼肌細胞出現(xiàn)了C形的雙層膜結(jié)構(gòu)和少量的自噬小體[14-15]。本實驗結(jié)果顯示：ND組、HFD組和HFD+EXE組骨骼肌細胞未出現(xiàn)自噬小體，但其相應(yīng)的自噬蛋白表達均明顯增加?？赡茉蛴校孩疟緦嶒炦\動干預(yù)方式是無負重游泳運動，與負重的游泳運動或跑臺運動相比，運動強度相對較低；⑵運動通過能量需求的增加模擬饑餓刺激促進細胞自噬，但運動的同時給予大鼠高脂飲食，自噬現(xiàn)象可能會出現(xiàn)相互抵消，從而表現(xiàn)為不明顯或無特異性的變化；⑶運動干預(yù)時間較短(1 h/d)，對骨骼肌刺激作用較??；⑷AMPK是骨骼肌細胞重要的調(diào)節(jié)因子[16]，高脂飲食可抑制AMPK蛋白表達，抑制細胞自噬。

3.3 有氧運動對IR大鼠骨骼肌自噬相關(guān)蛋白表達的影響

自噬蛋白LC3是Atg8的同源物，可分為LC3-I和LC3-II兩種。LC3-II定位在雙層膜和自噬體上，是自噬體的特異性標(biāo)志分子[16-18]，其含量和細胞自噬數(shù)量呈正比。同時，LC3-II/LC3-I比值與自噬泡的數(shù)量呈明顯正相關(guān)[19]，LC3-II/LC3-I比值大小是判斷自噬水平高低的依據(jù)。Beclin-1是自噬相關(guān)基因Atg6的同源物，不僅參與自噬體的形成過程，還有助于自噬體的成熟。Beclin-1一般不需要通過與 Bcl-2、mVps34、UVRAG、Bif-1、Barkor、Ambral等蛋白相互作用形成復(fù)合物就能發(fā)揮對細胞自噬的誘導(dǎo)作用[20]。

研究發(fā)現(xiàn)，小鼠進行高脂飲食飼養(yǎng)后，骨骼肌細胞LC3 mRNA表達顯著下降，p62 mRNA表達明顯上升，提示高脂飲食下骨骼肌細胞自噬水平下降[21]。Grumati等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠一次性跑臺訓(xùn)練1 h后，脛骨前肌LC3-II/LC3-I比值較對照組增加近4倍，提示一次性訓(xùn)練后自噬蛋白表達增加有利于受損細胞內(nèi)容物的清除，從而維持細胞的穩(wěn)態(tài)。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)性肥胖小鼠骨骼肌LC3mRNA和LC3-II/LC3-I比值下調(diào)，通過耐力運動和膳食的改善，能夠有效增加LC3-II的含量，緩解營養(yǎng)性肥胖機體細胞自噬水平的下降，從而使骨骼肌細胞自噬水平得以增加，維持細胞正常生理功能[24-25]。本實驗結(jié)果顯示：胰島素抵抗大鼠LC3-II蛋白表達和LC3-II/LC3-I比值均下調(diào)，提示隨著高脂飲食的持續(xù)喂養(yǎng)，骨骼肌細胞自噬水平不斷降低；8周游泳運動干預(yù)后，Beclin-1蛋白、LC3-II蛋白和LC3-II/LC3-I比值顯著上調(diào)，但并未達到空白對照組水平，提示適宜的運動訓(xùn)練能有效提高骨骼肌細胞自噬水平，且不會造成細胞自噬的過度激活，從而對細胞內(nèi)損傷的細胞器和代謝廢物進行清除。

運動強度可能是影響細胞自噬水平的重要因素。Feng等[26]研究指出，過度的運動訓(xùn)練可使Beclin-1、LC3表達顯著升高，且肌肉出現(xiàn)萎縮，推測過度訓(xùn)練引起細胞自噬的過度激活，導(dǎo)致過量降解骨骼肌細胞中的蛋白質(zhì)，引發(fā)肌肉萎縮和收縮能力下降，細胞的免疫功能也隨之降低。Hussey等[27-28]也提出，自噬水平變化僅在一定程度上受能量消耗調(diào)控，且中低強度運動可誘導(dǎo)最佳自噬水平表達。本研究的無負重游泳運動干預(yù)結(jié)果也證實了這一點。中等運動強度耐力運動能有效上調(diào)Beclin-1、LC3-II和 LC3-II/LC3-I比值，增強骨骼肌細胞代謝能力；大強度長時間耐力運動會導(dǎo)致骨骼肌纖維受損，自噬體增多異常，Beclin-1、LC3出現(xiàn)過表達的現(xiàn)象，進而導(dǎo)致骨骼肌細胞受損。

4 結(jié)論

高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠骨骼肌細胞自噬水平顯著下降；有氧運動可明顯增加的骨骼肌自噬水平，進而對受損的骨骼肌產(chǎn)生一定的保護作用。