嚴(yán) 玲 關(guān)紅菁 朱麗華 唐其柱

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的異常過度增殖是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后再狹窄的主要病理機(jī)制之一[1]。在促有絲分裂刺激下，如血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)-BB或血管損傷狀況，多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路被激活，促進(jìn)VSMCs異常增殖和再狹窄的發(fā)生、發(fā)展。這些信號(hào)通路包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 通路、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(Janus kinase, JAK/ signal transducer and activator of transcription, STAT)通路等[2～4]。針對于抑制VSMCs增殖以及調(diào)節(jié)信號(hào)通路的藥物干預(yù)可能成為防治再狹窄的治療策略。

白楊素(chrysin)又被稱為5,7-二羥黃酮(5,7-dihydroxyflavone)，是一種可從蜂膠、蜂蜜及多種植物中提取出的天然化合物，具有抗炎/抗氧化、促凋亡/抗腫瘤、擴(kuò)張血管、降低血脂、改善內(nèi)皮功能和胰島素抵抗相關(guān)血管并發(fā)癥等多種藥理學(xué)效應(yīng)，近年來其心血管保護(hù)作用也倍受重視[5～12]。筆者前期的體外實(shí)驗(yàn)顯示白楊素可顯著抑制PDGF-BB引起的VSMCs表型轉(zhuǎn)換、細(xì)胞遷移和異常增殖，然而其對體內(nèi)小鼠頸動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜增生的作用尚未見報(bào)道[13,14]。本研究首次在小鼠動(dòng)物水平，探討白楊素對頸動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷后新生內(nèi)膜增生的抑制效應(yīng)，并且從JNK和STAT信號(hào)通路方面，研究白楊素血管保護(hù)作用的可能分子機(jī)制。

材料與方法

1.材料：SPF級雄性C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所；金屬導(dǎo)絲(直徑0.38mm, No.C-SF-15-15)購于美國Cook公司；白楊素購于美國Sigma公司；抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；抗總的及磷酸化的JNK和STAT3抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；對二甲氨基偶氮苯(3,3′-diaminobenzidine, DAB)試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)和Horseradish Peroxidase Streptavidin購于美國Vector公司；檸檬酸鹽抗原修復(fù)溶液(pH值為6.0)購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；PDGF-BB購于美國ProSpec公司；DMEM/F12液及胎牛血清購于美國Gibco公司；Immobilon-FL膜購于美國Millipore公司。

2.頸動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷小鼠動(dòng)物模型的建立、分組與白楊素處理：參照筆者以往建模方法[15～17]，選取10周齡雄性C57BL/6小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉 (3%，90mg/kg)以麻醉小鼠，于頸前部正中切口，分離出頸外動(dòng)脈后將其結(jié)扎，繼而用血管夾夾閉頸內(nèi)與頸總動(dòng)脈，阻斷其血流，用顯微剪剪開頸外動(dòng)脈，將金屬導(dǎo)絲(直徑0.38mm)插入，來回進(jìn)行5次扭轉(zhuǎn)進(jìn)退操作以摩擦動(dòng)脈管壁，導(dǎo)致頸總動(dòng)脈的損傷，之后將導(dǎo)絲撤出，結(jié)扎頸外動(dòng)脈切口近心端，縫合皮膚。術(shù)后小鼠分成模型對照組(Vehicle組)和白楊素組(Chrysin組)，模型對照組小鼠喂以正常嚙齒類動(dòng)物飼料，白楊素組小鼠喂以含0.09%白楊素[w/w，如果根據(jù)每30g小鼠每天消耗5g飼料計(jì)算，相當(dāng)于150mg/(kg·d)的白楊素給藥劑量]的正常嚙齒類動(dòng)物飼料，飼養(yǎng)28天。于術(shù)后28天將小鼠處死，分離獲取損傷側(cè)的頸動(dòng)脈，用于檢測指標(biāo)。

3.評價(jià)新生內(nèi)膜形成：4%多聚甲醛固定頸動(dòng)脈，常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片 (3μm)，蘇木素-伊紅 (HE) 染色評價(jià)頸動(dòng)脈組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析計(jì)算：內(nèi)膜面積為內(nèi)彈力板環(huán)繞面積與管腔面積的差值，中膜面積為外彈力板與內(nèi)彈力板環(huán)繞面積的差值，內(nèi)/中膜比值為內(nèi)膜與中膜面積的比值。

4.PCNA免疫組化：石蠟切片經(jīng)脫蠟水化，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液高壓修復(fù)抗原，3%H2O2溶液室溫孵育10min，PBS漂洗后加入10%羊血清37℃封閉1h，滴加抗PCNA抗體4℃孵育過夜，PBS漂洗后加入Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)室溫孵育2h，PBS漂洗后加入Horseradish Peroxidase Streptavidin 37℃孵育30min，DAB顯色，陽性表達(dá)為深褐色，顯色完全后用Mayer蘇木素復(fù)染，脫水透明封片。在顯微鏡成像系統(tǒng)(BX51FL/DP72, 日本Olympus公司)下觀察拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，數(shù)據(jù)顯示為新生內(nèi)膜內(nèi)PCNA陽性染色的細(xì)胞數(shù)目。

5.細(xì)胞培養(yǎng)：參照參考文獻(xiàn)[13,14]，采用酶消化法分離大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)在DMEM/F12液(10%胎牛血清)里，待VSMCs生長到近融合狀態(tài)時(shí)予以傳代。VSMCs的純度利用細(xì)胞形態(tài)和α-SMA染色鑒定。實(shí)驗(yàn)使用VSMCs為5～12代。

6.細(xì)胞周期檢測：參照以往方法，見參考文獻(xiàn)[14]。碘化丙錠 (propidium iodide, PI) 染色法流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布狀態(tài)。VSMCs生長至70%融合時(shí)無血清培養(yǎng)24h。12.5μmol/L白楊素預(yù)處理1h后，加入PDGF-BB (20ng/ml)刺激24h。胰酶消化VSMCs，70%乙醇固定過夜，800r/min離心10min，收集細(xì)胞將其重懸于1ml的PI染色液(含20μg/ml PI和50μg/ml RNaseA)中，避光孵育30min，流式細(xì)胞儀檢測各時(shí)期的細(xì)胞百分比。

7.Western blot法檢測：同以往方法，見參考文獻(xiàn)[13,14]。VSMCs接種至6cm培養(yǎng)皿中，待生長至70%～80%融合時(shí)換無血清繼續(xù)培養(yǎng)24h。12.5μmol/L白楊素預(yù)處理2h后，給予PDGF-BB(20ng/ml)刺激相應(yīng)的時(shí)間。VSMCs用含蛋白酶抑制劑Complete及磷酸酶抑制劑PhosSTOP的細(xì)胞裂解溶液裂解，12000r/min離心20min，取上清，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白(上樣量為20μg蛋白/樣本)，隨后轉(zhuǎn)印至Immobilon-FL膜上。TBST洗膜液封閉1h，加不同的一抗，4℃孵育過夜，之后加IRDye?800CW標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，Odyssey Imaging System (Li-COR)獲取熒光信號(hào)。

結(jié) 果

1.白楊素遏制頸動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜增生：本實(shí)驗(yàn)12只小鼠術(shù)后均存活，Vehicle組有1只形成血栓未納入分析。頸動(dòng)脈HE染色顯示，Vehicle組術(shù)后28天新生內(nèi)膜形成非常明顯，而Chrysin組新生內(nèi)膜增生較模型對照組明顯減輕。形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)分析顯示，與Vehicle組比較，Chrysin組的內(nèi)膜面積和內(nèi)膜中膜比值均顯著降低，分別為Vehicle組的59.91%和56.04%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖1)。

圖1 白楊素遏制頸動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜增生與模型對照組比較，*P<0.05

2.白楊素遏制新生內(nèi)膜細(xì)胞增殖：頸動(dòng)脈免疫組化染色顯示術(shù)后28天 Chrysin組PCNA陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)較Vehicle組顯著減少, 陽性細(xì)胞數(shù)僅為Vehicle組的67.93% (圖2)，白楊素可顯著遏制頸動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜內(nèi)VSMCs增殖，從而減輕新生內(nèi)膜增生。

圖2 白楊素對新生內(nèi)膜內(nèi)PCNA表達(dá)的影響與模型對照組比較，*P<0.05

3.白楊素對PDGF-BB處理的VSMCs細(xì)胞周期的作用：各組別的細(xì)胞周期分布代表圖參見圖3。PDGF-BB刺激VSMCs 24h使G0/G1期細(xì)胞占比顯著低于模型對照組，而S期細(xì)胞占比明顯高于模型對照組。白楊素預(yù)處理顯著抑制PDGF-BB刺激的VSMCs增殖周期變化，使G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，而G2/M期細(xì)胞比例顯著降低(表1)。

4.白楊素對PDGF-BB引起的VSMCs中JNK磷酸化的作用：Western blot法檢測結(jié)果顯示20ng/ml PDGF-BB作用15min后顯著升高VSMCs中JNK的磷酸化表達(dá)水平，然而12.5μmol/L白楊素預(yù)處理幾乎完全抑制PDGF-BB引起的JNK磷酸化，PDGF-BB和白楊素對JNK總蛋白水平?jīng)]有明顯影響(圖4)。

5.白楊素對PDGF-BB引起的VSMCs中STAT3磷酸化的作用：Western blot法檢測結(jié)果顯示PDGF-BB作用15min后STAT3即發(fā)生顯著磷酸化，并持續(xù)到30min，而白楊素預(yù)處理顯著降低PDGF-BB對STAT3的磷酸化，PDGF-BB和白楊素對STAT3的總蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響(圖4)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析各組別的細(xì)胞周期分布

表1 白楊素對PDGF-BB處理的VSMCs細(xì)胞周期分布的作用

圖4 白楊素對PDGF-BB引起的VSMCs中JNK和STAT3信號(hào)通路活化的作用

討 論

VSMCs表型轉(zhuǎn)換、遷移和異常增殖參與了動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜增生的發(fā)生發(fā)展。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)白楊素預(yù)處理能阻止PDGF-BB引起的VSMCs收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)換，并顯著抑制PDGF-BB引起的VSMCs遷移[13]。同時(shí)，筆者還發(fā)現(xiàn)白楊素明顯抑制PDGF-BB引起的VSMCs增殖與DNA合成[14]。這些體外研究結(jié)果促使進(jìn)一步探討白楊素對體內(nèi)頸動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜增生的作用。本研究利用前期建立的成熟穩(wěn)定的小鼠頸動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷模型，首次發(fā)現(xiàn)口服給予白楊素可顯著抑制新生內(nèi)膜增生，并明顯降低新生內(nèi)膜中PCNA陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)[15～17]。該體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果又進(jìn)一步驗(yàn)證了前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)有力地支持白楊素對損傷誘導(dǎo)的血管重構(gòu)的保護(hù)效應(yīng)。

白楊素抑制動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜增生的詳細(xì)機(jī)制尚未完全闡明。鑒于VSMCs異常增殖加速新生內(nèi)膜增生，而PDGF-BB能強(qiáng)效刺激VSMCs增殖，本實(shí)驗(yàn)利用體外PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs增殖細(xì)胞模型進(jìn)一步探尋白楊素血管保護(hù)作用的可能分子機(jī)制。與前期研究一致的是，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示白楊素預(yù)處理使PDGF-BB引起的VSMCs增殖停滯在G0/G1期，從而遏制VSMCs增殖[14]。既往研究顯示，JNK通路和STAT3通路的活化與VSMCs異常增殖和新生內(nèi)膜形成密切相關(guān)[2～4]。

本實(shí)驗(yàn)隨后測定了白楊素對上述信號(hào)蛋白的影響，結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)的VSMCs中，20ng/ml PDGF-BB刺激誘導(dǎo)JNK和STAT3快速磷酸化，而12.5μmol/L白楊素預(yù)處理顯著抑制PDGF-BB對JNK和STAT3的磷酸化。該結(jié)果提示白楊素抑制PDGF-BB引起的VSMCs增殖的分子機(jī)制可能與其減弱JNK和STAT3活化相關(guān)。Lee等[18]報(bào)道白楊素在人成巨核細(xì)胞性白血病MO7e細(xì)胞中可抑制干細(xì)胞因子誘導(dǎo)的STAT3活化，Lin等[19]報(bào)道白楊素還能在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中抑制白介素-6誘導(dǎo)的STAT3活化，這些結(jié)果從一定程度上驗(yàn)證了本研究的可靠性。然而，白楊素究竟通過哪種具體的上游信號(hào)分子同時(shí)對JNK通路和STAT3通路發(fā)揮抑制效應(yīng)，尚待進(jìn)一步深入研究。白楊素抑制動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜形成是否與其抑制JNK和STAT3通路活化有直接因果關(guān)系還有待進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)白楊素可能經(jīng)由抑制JNK通路和STAT3通路活化，阻止血管平滑肌細(xì)胞異常過度增殖，從而減輕動(dòng)脈損傷后的新生內(nèi)膜增生。白楊素有望成為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后再狹窄的有效防治藥物。