馮 剛,李良平,樊友本,劉志蘇

(1.三峽大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院/宜昌市中心人民醫(yī)院甲乳外科,湖北宜昌 443000;2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院普通外科,上海 200000;3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院普通外科,武漢 430000)

乳腺癌是目前女性最為高發(fā)的惡性腫瘤之一，近年來，隨著現(xiàn)代分子診斷技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌的早期診斷和治療已取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，但乳腺癌的難治率和復(fù)發(fā)率仍然是急需解決的問題[1-2]。因此，尋找新的可行的乳腺癌診治方法一直是乳腺癌研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。微小RNA(miRNA，miR)可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與特異性靶基因的3′UTR配對(duì)，從而發(fā)揮對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)作用，此外miR可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達(dá)，即對(duì)某些mRNA產(chǎn)生降解作用從而抑制蛋白質(zhì)的合成，多項(xiàng)研究表明細(xì)胞的增殖凋亡與miR-34a相關(guān)[3-5]，miR-34a作為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要分子涉及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但目前關(guān)于乳腺癌的相關(guān)報(bào)道較少，本文檢測(cè)了miR-34a在各種乳腺癌細(xì)胞株中的水平，并將miR-34a模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞株中，觀察其細(xì)胞生物學(xué)行為變化，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并證實(shí)其作用機(jī)制，以期為乳腺癌的診斷及靶向治療提供新方向，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7、T47D、SK-BR-3和人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A均購于武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,熒光報(bào)告載體(pLUC)購于美國Promega公司。

1.1.2儀器和試劑 低溫高速離心機(jī)(Thermo Fisher公司，美國)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司，美國)；低溫高速離心機(jī)(Thermo Fisher公司，美國)；實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀(Stratagene公司，美國)；Transwell小室(Corning公司，美國)；ODYSSEY雙色紅外成像系統(tǒng)(LI-COR公司，美國)；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(北京天根生物公司，中國)；苯甲基磺酰氟(PMSF，Sigma公司，美國)；Trizol(Invitrogen公司，美國)；焦碳酸二乙酯(DEPC，Bio Basic公司，美國)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，中國)；TBS緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，中國)；牛血清清蛋白(Sigma公司，美國)；Lipofectamine2000(Invitrogen 公司，美國)；雙熒光酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒(Promega公司，美國)；miR-34a模擬物(Invitrogen公司，美國)；miR-34a抑制劑(Invitrogen公司，美國)；TaqMan?Micro RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies公司，美國)；TaqMan?Univsersal PCR Master MixⅡ(Life Technologies公司，美國)；TaqMan?Micro RNA分析試劑盒(Life Technologies公司，美國)；Wnt1兔抗人多克隆抗體(Proteintech公司，美國)；β-catenin兔抗人多克隆抗體(Proteintech公司，美國)；CyclinD1兔抗人多克隆抗體(Proteintech公司，美國)；熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)儀(Promega公司，美國)；CCK8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司，中國)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以3×105～4×105個(gè)/孔的量取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞鋪于6孔板中，用無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞融合度應(yīng)達(dá)到50%～60%。無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次除去殘余血清。每孔加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基1.5 mL。5 μL Lipofectamine2000加入250 μL無血清培養(yǎng)液中，移液器混勻，室溫放置5 min。5 μL miR-34a模擬物、抑制劑或其陰性對(duì)照加入250 μL無血清培養(yǎng)基中混勻，室溫放置5 min。將上述兩種液體混合，混勻室溫放置20 min。500 μL混合液加入每孔細(xì)胞，搖勻后放于37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6～8 h后更換含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RNA提取及RT-PCR 去培養(yǎng)基后直接加入Trizol，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，收集Trizol至離心管中，室溫放置上述樣品液10 min，每毫升Trizol中加入氯仿200 μL，劇烈振蕩1 min，室溫靜置5 min，12 000 r/min 4 ℃冷凍離心15 min，取出樣品吸取上清液約450 μL至含有600 μL冷凍異丙醇的新離心管中，混勻，12 000 r/min 4 ℃冷凍離心10 min去上清液，加入500 μL冷凍的75%乙醇，彈起沉淀后12 000 r/min 4 ℃冷凍離心5 min，去上清液。風(fēng)干5～10 min加入DEPC約30 μL，-80 ℃保存。分光光度計(jì)Nanodrop上測(cè)定RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄具體操作步驟按照TaqMan?Micro RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。按照16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將得到的產(chǎn)物保存于4 ℃。冰上配制反應(yīng)體系并加入8聯(lián)排PCR管中。按照95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)。miR-34a正向引物：5′-GGG TGG CAG TGT CTT AGC T-3′，反向引物：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；內(nèi)參U6正向引物：5′-GCG CGT CGT GAA GCG TTC-3′,反向引物：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以2-△△CT法計(jì)算，用相對(duì)定量表示。

1.2.3CCK-8法 收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，將細(xì)胞制成密度為2×104個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液。在96孔板中接種單細(xì)胞懸液(100 mL/孔)，將培養(yǎng)板放于37 ℃孵箱進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)5復(fù)孔，以只加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為空白孔，培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后分別向各孔中加入CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板放入37 ℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度(OD450 nm)。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn) 根據(jù)公司操作說明書，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300 μL預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15～30 min，使基質(zhì)膠水化，再吸去剩余培養(yǎng)液，制備細(xì)胞懸液，制備細(xì)胞懸液前讓細(xì)胞在無血清條件下饑餓12～24 h，消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，用含牛血清清蛋白的無血清培養(yǎng)基重懸。取細(xì)胞懸液100～200 μL加入Transwell小室上室中，加入500 μL含胎牛血清的培養(yǎng)基于下室，常規(guī)培養(yǎng)12～48 h后直接計(jì)數(shù)。

1.2.5雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 將報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-34a模擬物共轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞中，48 h后收取細(xì)胞，吸除培養(yǎng)基，用1×PBS輕柔洗2遍，加入1×被動(dòng)裂解液(PLB)反應(yīng)液80～10 μL，每3～5分鐘搖晃1次，室溫放置15 min；將裂解液轉(zhuǎn)移至無菌小管，120 r/min離心30 s，取上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌小管。將40 μL LARⅡ加入一次性測(cè)量管中，將10 μL細(xì)胞裂解液加入其中，混勻，放入熒光儀開始測(cè)量，記錄螢火蟲熒光素酶讀數(shù)，加入40 μL Stop&GloReagent，混勻，放入熒光儀開始測(cè)量，記錄內(nèi)參海腎熒光素酶讀數(shù)，繼續(xù)測(cè)量其他樣品，計(jì)算兩種熒光素酶讀數(shù)的比值，取3個(gè)平行孔的平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 將收集的細(xì)胞中加入適量RIPA裂解液，放置冰上30 min。期間每10 min超聲破碎1次。4 ℃條件下，12 500 r/min離心10 min。取上清液，以BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，分裝保存。接通電源，直至溴酚藍(lán)電泳至分離膠底部，切斷電源，取出凝膠，按照蛋白Marker指示切下所需部分，開啟電源，4 ℃條件下轉(zhuǎn)膜1.5 h后切斷電源。轉(zhuǎn)膜后聚偏氟乙烯(PVDF)膜浸入5%脫脂牛奶中，置搖床上室溫封閉2 h，以稀釋好的抗體Wnt1、β-catenin、CyclinD1、GAPDH孵育封閉后的PVDF膜，4 ℃過夜。將膜取出，TBST清洗3次，每次10 min，稀釋后的熒光二抗工作液37 ℃孵育40 min。TBS再次清洗3次，每次10～15 min。ODYSSEY雙色紅外成像系統(tǒng)掃描成像并計(jì)算灰度值。

2 結(jié) 果

2.1miR-34a在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平 取正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中miR-34a的表達(dá)量為1，得出乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7、T47D、SK-BR-3中miR-34a的相對(duì)表達(dá)水平，可見miR-34a在多個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中水平均顯著下調(diào)(t=5.34,t=3.75,t=6.23，t=6.91,P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與MCF-10A比較

圖1 miR-34a在正常乳腺上皮細(xì)胞和不同乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平

2.2miR-34a對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖活性的影響 分別將miR-34a模擬物及抑制劑轉(zhuǎn)染入MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中，采用RT-PCR檢測(cè)不同組中miR-34a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR-34a抑制劑組中miR-34a的表達(dá)水平顯著降低，而miR-34a模擬物組中miR-34a的表達(dá)水平顯著升高。根據(jù)CCK-8法檢測(cè)結(jié)果繪制乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的生長曲線，miR-34a模擬物組細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.26，P<0.05)，而miR-34a 抑制劑組細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.26，P<0.05)，見圖2。

2.3miR-34a對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 兩種乳腺癌細(xì)胞在培養(yǎng)72 h后，乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力均顯著降低，在MCF-7細(xì)胞系中，miR-34a模擬物組穿過小室的數(shù)目與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.82，P<0.01)；在MDA-MB-231細(xì)胞系中，miR-34a模擬物組穿過小室的數(shù)目與對(duì)照組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.35，P<0.05)，見圖3。

2.4雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-34a對(duì)Wnt1蛋白的直接靶向作用 通過靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan(http://www.targetscan.org/)和miRanda(http://www.microrna.org/)進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示miR-34a與Wnt1 mRNA的3′UTR之間存在互補(bǔ)配對(duì)序列。WT組、Mut組和對(duì)照組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48 h后進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，結(jié)果表明共轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物和pLUC-Wnt1-WT-3′UTR的乳腺癌細(xì)胞中熒光素酶活性強(qiáng)度顯著低于其他組(t=11.28，P<0.01)，見圖4。

A：MCF-7細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后miR-34a表達(dá)水平；B：MCF-7細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染組生長曲線；C：MDA-MB-231細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后miR-34a表達(dá)水平；D：MDA-MB-231細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染組生長曲線；a：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖2不同乳腺癌細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后miR-34a相對(duì)表達(dá)水平及生長曲線圖

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖3 miR-34a對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖4兩組Wnt1-3′UTR雙熒光素酶檢測(cè)對(duì)比

2.5miR-34a對(duì)Wnt1蛋白表達(dá)的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后通過Western blot檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物和miR-34a抑制劑的乳腺癌細(xì)胞MCF-7中Wnt1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染后miR-34a模擬物組Wnt1的相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.32，P<0.01)，miR-34a抑制劑組Wnt1相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.85，P<0.05),見圖5。

A：轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后各組Wnt1蛋白的Western blot；B：轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后各組Wnt1蛋白相對(duì)表達(dá)水平；a：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖5 miR-34a對(duì)乳腺癌細(xì)胞Wnt1蛋白表達(dá)的影響

圖6 miR-34a模擬物組及對(duì)照組β-catenin、CyclinD1蛋白的表達(dá)情況

A:轉(zhuǎn)染24 h后的各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平；B:轉(zhuǎn)染48 h后的各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平;a:P<0.05，與對(duì)照組比較

圖7 miR-34a模擬物組及對(duì)照組β-catenin和CyclinD1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

2.6miR-34a對(duì)β-catenin和CyclinD1蛋白的影響 Western blot檢測(cè)miR-34a模擬物組轉(zhuǎn)染24和48 h后β-catenin和CyclinD1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-34a模擬物轉(zhuǎn)染24 h后β-catenin和CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著下降，48 h后β-catenin和CyclinD1蛋白的表達(dá)仍顯著下降，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.25，t=11.36，P<0.05；t=13.57，t=12.24，P<0.05)，見圖6、7。

3 討 論

miR是一種長度約為22 NT的非編碼miR，目前已有許多研究證實(shí)miR與疾病的發(fā)生、發(fā)展具有非常密切的關(guān)系[6-9]，通過與正常表達(dá)譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)miR參與了惡性腫瘤與其他眾多慢性疾病的發(fā)生，并對(duì)這些疾病的生理、病理過程產(chǎn)生顯著的調(diào)控作用，如調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等，且還會(huì)影響這些疾病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后，甚至?xí)@著影響患者的生存期[10-11]。miR-34a是miR家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞的周期、衰老、凋亡都與miR-34a有著直接的關(guān)聯(lián)[12-13]。還有研究表明，miR-34a在胃癌[14-15]、腦膠質(zhì)瘤[16]、肝癌[17-18]和結(jié)直腸癌[19-20]中表達(dá)水平顯著下調(diào)，且表現(xiàn)出組織依賴性，即不同的癌組織中miR-34a表達(dá)下調(diào)程度不同[21]。

Wnt信號(hào)通路在惡性腫瘤中具有重要作用，其機(jī)制為影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附能力及血管再生[22]。目前認(rèn)為，Wnt通路致癌關(guān)鍵是β-catenin降解障礙致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離β-catenin聚集并與Tcf/Lef結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核，從而激活下游靶基因CyclinD1、C-myc的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[23-24]。CyclinD1是調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入增生期的主要因子，已被證實(shí)為原癌基因，其過度表達(dá)和失調(diào)控均可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常從而發(fā)生腫瘤，乳腺癌組織中存在著異常Wnt通路，其多個(gè)成員均參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，β-catenin的異常表達(dá)可能通過促使或激活CyclinD1的過表達(dá)導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。已有研究證明miR-100、miR-1和miR-142通過抑制或增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展[25-27]。

本研究結(jié)果表明在過表達(dá)miR-34a的情況下，乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力受到明顯抑制，而抑制乳腺癌細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力則明顯增加。進(jìn)一步的機(jī)制研究中，證明了miR-34a的直接靶基因是Wnt1蛋白，過表達(dá)miR-34a能顯著抑制Wnt1的表達(dá)，同時(shí)也影響了Wnt信號(hào)通路的下游關(guān)鍵基因β-catenin、CyclinD1的表達(dá)，從而影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，即乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力受到抑制的原因是由于miR-34a通過直接靶向Wnt1基因，從而影響其下游基因的表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生上述細(xì)胞學(xué)行為，在體外實(shí)驗(yàn)中，乳腺癌細(xì)胞侵襲能力和增殖能力發(fā)生顯著改變，提示乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與miR-34a表達(dá)水平密切相關(guān)，miR-34a表達(dá)水平的檢測(cè)可以作為乳腺癌診斷的參考指標(biāo)，對(duì)于臨床上乳腺癌早期診斷和早期治療提供了新的思路和方向。