段大鵬 秦 靜 祁 潔 劉 軍 李全義 弓立群

骨肉瘤為青少年兒童最常見(jiàn)的骨科惡性腫瘤，其轉(zhuǎn)移率和病死率高，常規(guī)治療效果不佳[1-3]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用非甾體類(lèi)抗炎藥能有效降低惡性腫瘤的發(fā)生幾率[4]。本研究基于既往研究，觀察塞來(lái)昔布對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其與PI3K/Akt信號(hào)通路之間關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

塞來(lái)昔布(Celecoxib)購(gòu)自美國(guó)Pfizer公司；人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；COX-2、CAS-3和P-Akt抗體購(gòu)自SantaCruz公司；雙抗購(gòu)自山東魯抗制藥公司；二甲基亞砜(DMSO)、四氮噻唑鹽(MTT)等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

自液氮中取出人骨肉瘤MG-63細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)用含15%胎牛血清、100 μg/ml青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞貼壁融合度為85%時(shí)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)MG-63細(xì)胞加無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別加入含0、25、50及100 μmol/L塞來(lái)昔布的培養(yǎng)液。在加藥24、48和72 h后，避光加新配制5 mg/ml MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h棄培養(yǎng)液后，加DMSO 10 min后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

采用 Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)。將MG-63細(xì)胞以105/ml細(xì)胞密度接種，設(shè)0、25、50和100 μmol/l 4個(gè)組別。細(xì)胞繼續(xù)培育48 h，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，1 500 rpm離心5 min，棄上清后依次加入500 μl的1×Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI，室溫反應(yīng)10 min流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4 Western blot法檢測(cè)COX-2、CAS-3和P-Akt蛋白表達(dá)

培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞同步化后分組干預(yù)，收集細(xì)胞提取MG-63細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。電泳至溴酚藍(lán)抵達(dá)分離膠底部結(jié)束電泳，取下凝膠并作標(biāo)記，入電轉(zhuǎn)緩沖液平衡5 min后轉(zhuǎn)膜。然后抗原抗體反應(yīng)。蛋白的表達(dá)水平以GAPDH進(jìn)行標(biāo)化，通過(guò)軟件進(jìn)行灰度掃描并定量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 塞來(lái)昔布對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨劑量增大而升高，尤以100 μmol/l組最為明顯，且與作用時(shí)間呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果

2.2 塞來(lái)昔布對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)分析Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組凋亡指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度塞來(lái)昔布對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 塞來(lái)昔布對(duì)MG-63細(xì)胞COX-2、CAS-3和P-Akt蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較COX-2、CAS-3和P-Akt蛋白表達(dá)水平明顯下降,經(jīng)檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同濃度塞來(lái)昔布對(duì)MG-63細(xì)胞COX-2、CAS-3和P-Akt蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨肉瘤惡性程度高、預(yù)后差，局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生早，治療效果往往不滿意[5-6]。PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化調(diào)節(jié)，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中具有重要地位[7]。在許多腫瘤中，PI3K/Akt信號(hào)通路活化，成為抗腫瘤藥物耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)[8]。

塞來(lái)昔布為特異性COX-2抑制劑，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)換氧化酶的水平，抑制下游炎癥信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而抑制細(xì)胞增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布抑制 Akt 信號(hào)通路，可增強(qiáng)sorafenib對(duì)肝細(xì)胞癌的抗腫瘤活性，提示 Akt是塞來(lái)昔布的作用靶點(diǎn)之一[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞均有抑制和促凋亡作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度塞來(lái)昔布作用于人骨肉瘤MG-63細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可抑制細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間和濃度依賴性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度塞來(lái)昔布處理的MG-63細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象。這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致[11]。

COX-2抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑包括COX-2依賴性途徑和非COX-2依賴性途徑[12]。其中非COX-2依賴性途徑抗腫瘤機(jī)制目前多家說(shuō)法不一[13-14]。本實(shí)驗(yàn)在觀察塞來(lái)昔布抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡作用同時(shí),對(duì)其機(jī)制作了進(jìn)一步探討。提示不同濃度的塞來(lái)昔布作用于MG-63細(xì)胞后，CAS-3和P-Akt蛋白的表達(dá)下調(diào)，表明其作用機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，塞來(lái)昔布對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。