林彥霞，白 睿，劉志強(qiáng)，劉惠亮

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic acid-glycolic acid copolymer，PLGA)具有良好的生物可降解和生物相容性，是由美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的可安全使用的藥用高分子材料，其降解作用可實(shí)現(xiàn)緩釋藥物的目的[1，2]。PLGA多聚物分子表面可以與多種生物分子通過共價(jià)或物理吸附有效結(jié)合，可以通過結(jié)合適配體、多肽及核酸等建立靶向系統(tǒng)，既能增大靶部位的藥物濃度又可以在體內(nèi)遞送中減少創(chuàng)傷[3-5]。因PLGA系統(tǒng)具有控制顆粒大小、控制藥物釋放、延長藥物釋放時(shí)間、靶向釋放、降低藥物毒性和刺激性、保護(hù)藥物活性、提高治療效果[6]等特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于包載藥物[7-11]。微米和納米兩種粒徑顆粒都是常用的藥物載體，但面對不同組織損傷類型，如何選擇不同顆粒類型，仍然缺乏直接的研究依據(jù)，以致不同研究報(bào)道中用法多樣[12]。本研究在表面特征、載藥能力、藥物緩釋能力，以及細(xì)胞吞噬能力等方面對兩種PLGA顆粒進(jìn)行了評價(jià)，以期為如何選擇合適的PLGA顆粒提供一種策略。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-10C型)，ChampGel攝像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)，紫外分析儀(北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司)，紫外可見分光光度計(jì)(UV2800，上海)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(3111REL#5，US),超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(SCIENTZ-IID,中國)，激光粒度及電位分析儀(NANO ZS-90,英國 Malvern)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 PLGA(PLGA-50:50，由山東省藥學(xué)科學(xué)院、山東省醫(yī)療器械研究所提供)，二氯甲烷(DCM)，聚乙烯醇(PVA, sigma)，聚乙烯亞胺(PEI)，褪黑素(melatonin)，香豆素，核酸(質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室合成)。

1.2 方法

1.2.1 采用超聲乳化方法制備PLGA納米顆粒 載褪黑素的納米顆粒[13-15]即蒸餾水5 ml,5%PVA5 ml，二者作為外水相，油相即0.03 g褪黑素和0.10 g PLGA固體顆粒加入2 ml DCM形成乳液，超聲5～10min，制備納米顆粒。

1.2.2 采用機(jī)械攪拌乳化方法制備PLGA微米顆粒 載褪黑素微米顆粒[16-18]，方法同納米粒制備的水相和油相，溶液放于振蕩器上震蕩5～10 min，制備微米顆粒。

1.2.3 表面特征檢測 兩種顆粒采用透射電鏡、掃描電鏡和動態(tài)光散射檢測，評價(jià)其各自的表面特征，粒徑均一性。

1.2.4 兩種顆粒的載藥量，藥物緩釋 兩種載藥顆粒最后分別用2 ml水重懸沉淀，各取兩管100 μl重懸溶液，于紫外可見分光光度計(jì)下測其吸光度，同時(shí)另100 μl制備好的載藥納米顆粒與微米顆粒，測其質(zhì)量，計(jì)算載藥量。兩種顆粒分別各取兩管，每管300 μl，均用500 μl PBS溶液重懸沉淀，放于37 ℃孵箱，分別收集上清于新的EP管中，最后用紫外可見分光光度計(jì)測其278 nm處的褪黑素吸光度。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的濃度，最后計(jì)算兩種顆粒的藥物累積釋放率，并繪制圖表。

1.2.5 細(xì)胞吞噬 體外培養(yǎng)人胚腎293T細(xì)胞株，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照5×104/孔將293T細(xì)胞接種在6孔板中，分四組，每組設(shè)兩個(gè)副孔，四組細(xì)胞分別于6、12、24、48 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞吞噬情況。PLGA固體顆粒與熒光材料香豆素共溶于二氯甲烷，平分兩份分別制備微米和納米顆粒。最后制備成等量的溶液，各加6 μl氨芐西林鈉，放于4 ℃，過夜。每孔細(xì)胞各加10 μl樣品。

1.2.6 熒光強(qiáng)度測定 利用軟件IPP6.0分析測定細(xì)胞吞噬的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 空載PLGA顆粒的表面特征 微米顆粒表面很光滑，典型的球形結(jié)構(gòu)，粒徑不均一，大致范圍為3～5 μm，結(jié)果如圖1A。納米顆粒粒徑相對均一，范圍為200～300 nm，如圖1B所示。納米顆粒采用馬爾文ZS90粒度分析儀來檢測顆粒的水合粒徑，結(jié)果與掃描電鏡檢測結(jié)果相似見圖1C。微米顆粒結(jié)果如圖1D，粒徑大部分分布在2～5 μm的范圍內(nèi)。

圖1 兩種空載PLGA顆粒的表面特征檢測結(jié)果

A.微米米顆粒的掃描電鏡檢測結(jié)果；B.納米顆粒的掃描電鏡檢測結(jié)果；C.納米顆粒的粒徑分布范圍；D.微米顆粒的粒徑分布范圍

2.2 藥物緩釋比較 納米顆粒存在顯著的早期突釋現(xiàn)象，大部分藥物在12 h內(nèi)釋放，后續(xù)仍可緩慢持續(xù)釋放2～4 d，見圖2A；微米顆粒釋放時(shí)間較長，持續(xù)緩釋可達(dá)一周左右，見圖2B。

圖2 兩種顆粒的藥物緩釋圖

2.3 細(xì)胞吞噬情況 納米顆粒與細(xì)胞共孵育12 h即達(dá)到最大值，如圖3-NP，微米顆粒24 h即達(dá)到最大值，如圖3-MP。檢測熒光強(qiáng)度可見納米顆粒12 h即達(dá)到最大值，見圖3A；微米顆粒相對較慢，最大值出現(xiàn)在共孵育24 h后，見圖3B。

圖3 兩種顆粒的細(xì)胞吞噬

A.納米顆粒的細(xì)胞吞噬熒光強(qiáng)度，*代表12 h時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到高峰；B.微米顆粒的細(xì)胞吞噬熒光強(qiáng)度，*代表24 h熒光強(qiáng)度達(dá)到高峰

3 討 論

多種具備生物可降解性、安全性的高分子聚合物已經(jīng)被廣泛地作為藥物載體使用。其中PLGA 具有良好的生物相容性和可降解性，并且是被 FDA 批準(zhǔn)的藥用高分子材料。因此，其作為載體包裹藥物形成顆粒是載藥系統(tǒng)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

在本研究中，我們制備了兩種粒徑范圍的顆粒，并且在二者的各種應(yīng)用性能方面進(jìn)行了比較[1,8,11,12]，評價(jià)PLGA納米顆粒與微米顆粒的表面特征、載藥能力、藥物緩釋能力及細(xì)胞吞噬能力等方面。結(jié)果顯示納米顆粒的粒徑均一性較好，可能是因?yàn)榧{米顆粒采用超聲技術(shù)相比微米顆粒的機(jī)械攪拌方法制得的顆粒均勻性更好，且兩種顆粒呈現(xiàn)出明顯的球形結(jié)構(gòu)且形態(tài)規(guī)整。兩種顆粒攜帶褪黑素的能力相當(dāng)，在藥物緩釋方面，納米顆粒存在顯著的早期突釋現(xiàn)象，大部分藥物在12 h內(nèi)釋放；微米顆粒釋放時(shí)間較長，持續(xù)緩釋可達(dá)一周左右，可見PLGA納米顆粒作為化學(xué)藥物載體更適合于急性組織或細(xì)胞保護(hù)，微米顆粒更適合于慢性持續(xù)性保護(hù)；在攜帶藥物進(jìn)入細(xì)胞能力方面，分別在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞對顆粒的吞噬情況，粒徑相對小的PLGA納米粒更容易進(jìn)入或與細(xì)胞結(jié)合，微米顆粒相對較慢。

本研究通過對PLGA兩種顆粒各方面進(jìn)行評價(jià)，得出了二者的不同應(yīng)用范疇。結(jié)果證明微米顆粒控釋系統(tǒng)適用于半衰期短、口服生物利用度低、需要長期使用的藥物，其優(yōu)點(diǎn)在于幾周甚至幾個(gè)月時(shí)間內(nèi)仍能釋放藥物，維持有效血液濃度，減少藥物的給藥次數(shù)，增強(qiáng)治療效果。緩釋的不同是因?yàn)樗幬锸莾?nèi)包于顆粒中，緩釋與顆粒的比表面積成正比[19]，與微米顆粒相比，納米顆粒粒徑小，比表面積大，故而釋放的快；對于細(xì)胞吞噬，納米顆粒由于粒徑小易被細(xì)胞吞噬，在12 h便達(dá)到吞噬高峰，而微米顆粒則24 h達(dá)到吞噬高峰，吞噬高峰之后由于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的顆粒降解藥物釋放，故熒光強(qiáng)度降低。對于兩種顆粒的應(yīng)用，當(dāng)前很多研究報(bào)道了基于PLGA顆粒的多種修飾方法可以使顆粒系統(tǒng)達(dá)到藥物緩慢釋放的目的[10,20,21]，但最終能否滿足實(shí)驗(yàn)要求，仍需進(jìn)一步探索。

本研究結(jié)果表明，PLGA納米顆粒作為藥物控釋載體更適合于急性組織或細(xì)胞保護(hù)，微米顆粒更適合于慢性持續(xù)性保護(hù)，對于我們之后如何選擇不同粒徑的PLGA顆粒提供了參考價(jià)值，期望能夠更高效發(fā)揮兩種顆粒的應(yīng)用價(jià)值。