寧 粵，歐陽雅琦，鄭汝婷，侯愛香

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

蕨菜具有清熱利濕、消腫、利水、安神等藥用價值[1-2]。有研究者對蕨菜中黃酮、多糖類功能成分等進(jìn)行提取探索，如采用乙醇回流法提取蕨菜中的總黃酮、采用超聲波法提取蕨菜中的水溶性膳食纖維和多糖，其提取率分別可達(dá)10.33%、36.01%和25.69%[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，蕨菜中黃酮類化合物和多糖均可以較好地清除DPPH自由基，二者在一定濃度范圍內(nèi)均與DPPH自由基的清除率呈正相關(guān)[6]。國內(nèi)目前更多的研究是對蕨菜進(jìn)行加工處理，也有新鮮蕨菜加木糖醇、檸檬酸等輔料，以生產(chǎn)適合糖尿病等患者食用的功能性飲料[7]，但這些蕨菜研究開發(fā)中，普遍忽視了蕨菜作為日常佐餐菜肴是否危害人體健康的問題。M Campos-Da-Paz等[8]研究表明，用蕨菜提取物單獨處理細(xì)胞，細(xì)胞會表現(xiàn)出染色質(zhì)縮合、細(xì)胞質(zhì)體積丟失等凋亡形態(tài)學(xué)特征，并且蕨類植物中的有害物質(zhì)會增加胃癌發(fā)病率和上消化道腫瘤的發(fā)生風(fēng)險[9-10]，蕨菜中含有的蕨苷可以通過降低CD8+T細(xì)胞的激活和在hpv誘導(dǎo)的病變中的脫粒，發(fā)揮免疫抑制作用，而增加病毒持久性和侵襲性，并促進(jìn)腫瘤形成[11]。這些研究結(jié)論與本課題組前期研究結(jié)果相符，筆者發(fā)現(xiàn)，1g/mL的蕨菜液平均縮短秀麗隱桿線蟲壽命6.06d，對生殖能力損害較強(qiáng)[12]。保持體內(nèi)自由基和抗氧化劑的平衡可以延緩衰老[13-14]?；钚匝踝?ROS)是含有氧并具有高反應(yīng)活性的一類自由基或分子[15]，通過對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、蛋白分子等產(chǎn)生氧化作用或自身含量增多導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)造成細(xì)胞損傷而引起其結(jié)構(gòu)和功能障礙[16]。機(jī)體通過利用超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等酶類可去除細(xì)胞生成的ROS[17]而維持ROS的平衡，谷胱甘肽(GSH)也是一種具有清除自由基的作用的三肽類組織，且?guī)缀醮嬖谟谏眢w的每一個細(xì)胞[18]。

通常自由基的檢測較為困難，本研究以秀麗隱桿線蟲為模式生物測定ROS水平、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、SOD、CAT，BCA法測秀麗隱桿線蟲總蛋白的方法，間接測定其體內(nèi)自由基含量[19]，進(jìn)而了解其抗氧化作用。因秀麗隱桿線蟲與人體基因相似，為進(jìn)一步研究蕨菜液的生理功能，探索蕨菜食用安全性，本研究參考中國人將蕨菜植株去頭去尾后腌制或烹制的采食習(xí)慣，繼續(xù)以秀麗隱桿線蟲為模式生物，測定喂食蕨菜液后秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS含量，GSH-Px、SOD、CAT活力以及細(xì)胞凋亡情況，對蕨菜體內(nèi)抗氧化作用進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕨菜，湖南湘西雪峰山。野生型秀麗隱桿線蟲以及大腸桿菌OP50，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室。NGM培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、M9緩沖液、2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酯(H2DCF-DA)；GSH-Px測試盒、SOD測試盒、CAT測試盒、秀麗隱桿線蟲總蛋白試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD單人單面凈化操作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實驗有限公司；連續(xù)變倍體式顯微鏡，MoticSMZ-168型，麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司；MJX-250B-Z電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，美國Therm Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1蕨菜提取液的制備

(1)新鮮蕨菜提取液的制備：取去頭去尾的新鮮野生蕨菜100g切碎，加100mL蒸餾水榨汁，紗布過濾，取濾液滅菌，制成1.00g/mL和0.2g/mL的新鮮蕨菜提取液。(2)腌制蕨菜水溶提取液的制備：取去頭去尾的新鮮野生蕨菜進(jìn)行腌制，再取腌制蕨菜100g切碎，加100mL蒸餾水榨汁，紗布過濾，取濾液滅菌，制成1.00g/mL和0.2g/mL的腌制蕨菜提取液。

1.3.2秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)及同期化 參照文獻(xiàn)[20]的方法并做適當(dāng)修改：用無菌水進(jìn)行沖洗平板，收集帶有蟲液的無菌水于錐形管，用無菌水離心(2 000r/min，2min)洗3次，每次離心后去上清再加適量無菌水(目的在于洗去大腸桿菌)。加入裂解液(1.5mLNaClO、3.5mL無菌水、5mL NaOH)于錐形管，50mL蟲液對應(yīng)10mL裂解液，蟲液密度大時適當(dāng)增加裂解液的量。放在漩渦震蕩儀上震蕩至蟲體均破碎(在顯微鏡下觀察)，即為卵懸液。加入與裂解液等體積的M9緩沖液離心(3 000r/min，2min)洗3次，每次離心后去上清再加適量M9緩沖液(目的在于洗去裂解液)。用完全培養(yǎng)基再離心清洗1次(3 000r/min，2min)以洗去M9緩沖液，去上清后，將卵懸液轉(zhuǎn)移至錐形瓶，用完全培養(yǎng)基定容至50mL。將錐形瓶放在搖床上20℃培養(yǎng)29h。29h后加入大腸桿菌1.5mL(每毫升蟲液加入30μL大腸桿菌)搖床20℃培養(yǎng)38h。

1.3.3秀麗隱桿線蟲給藥操作 向經(jīng)38h培養(yǎng)的蟲液中加入配好的FUDR試劑繼續(xù)培養(yǎng)12h(加入FUDR抑制產(chǎn)卵)，加入提取液進(jìn)行處理24h，分5管各為新鮮蕨菜提取液0.2、1.0g/mL和腌制蕨菜提取液0.2、1.0g/mL以及空白對照組(加等量蒸餾水)。

1.3.4秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力的測定 給藥24h后，將盛有線蟲的錐形管離心去上清，并用PBS定容至3mL，再于超聲波細(xì)胞破碎儀以破碎功率800 W、破碎總時間8min為超聲參數(shù)對線蟲進(jìn)行破碎。在顯微鏡下觀察，待蟲體裂解后，將混合液5 000r/min離心10min，將上清液小心轉(zhuǎn)移至新離心管中，冰水浴冷卻，5 000r/min離心10min，上清液即為酶液提取液，將酶液提取液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5秀麗隱桿線蟲體ROS水平的測定

(1)ROS水平的測定：給藥24h后，將蟲液離心(2 500r/min，2min)去上清(除去培養(yǎng)液)，用PBST離心(2 500r/min，2min)洗滌秀麗隱桿線蟲2次，以除去OP5O及雜質(zhì)；再于超聲波細(xì)胞破碎儀以破碎功率900 W、破碎總時間12 s(超聲3 s、間隔3 s)為超聲參數(shù)對線蟲進(jìn)行破碎。在顯微鏡下觀察，待蟲體裂解后，將混合液5 000r/min離心10min，將上清液小心轉(zhuǎn)移至新離心管中，冰水浴冷卻，5 000r/min離心10min，取上清即組織液于新的1.5mL離心管中。嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒說明書要求，進(jìn)行線蟲總蛋白測定并記錄數(shù)據(jù)。同時進(jìn)行ROS水平的測定，向96孔板中加入80μL組織液，再加入20μL H2DCF-DA；將96孔板放置于20℃搖床孵育30min，并蓋上蓋子，以免蒸發(fā)；利用多孔化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行熒光檢測，激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長535nm。

(2)數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理：采用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以百分比呈現(xiàn)。

1.3.6秀麗隱桿線蟲細(xì)胞凋亡的影響分析 吸取各組蟲液各100μL于96孔板，加入100μL吖淀橙，染色1.5h(避光)后，用M9洗滌，挑取用M9洗滌過的線蟲于NGM板上，使線蟲恢復(fù)活力10min。用3%的瓊脂糖制作瓊脂平面，待凝固吸取1滴100μg/mL疊氮化鈉于瓊脂平面中央，再挑取10～15條蟲于溶液中，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察，通過與對照組熒光強(qiáng)度大小以及各組相互之間熒光強(qiáng)度的對比來進(jìn)行判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 秀麗隱桿線蟲體內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT活力分析

如圖1所示，與對照組相比，新鮮蕨菜液和腌制1.0g/mL組均可抑制線蟲體內(nèi)3種抗氧化酶的活性，而腌制0.2g/mL組對線蟲GSH-Px活性也有抑制作用卻不如前兩組明顯，但對CAT和SOD兩種酶活性有輕微的抑制作用。4組不同處理的蕨菜液均對線蟲GSH-Px活力有抑制作用，但效果并不一致，2組新鮮蕨菜液作用效果差別不大，線蟲體內(nèi)GSH-Px活力分別為對照組的0.58、0.56倍，而2組腌制蕨菜液作用效果差別同樣很小，線蟲體內(nèi)GSH-Px活力分別為對照組的0.83、0.9倍，其抑制作用不如新鮮蕨菜液組。與腌制0.2g/mL組相比，其他3種處理方法均能抑制線蟲體內(nèi)CAT和SOD活力，腌制0.2g/mL線蟲體內(nèi)CAT、SOD活力分別為對照組的1.05、1.1倍，與新鮮1.0g/mL組、新鮮0.2g/mL組、腌制1.0g/mL組相比，腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)CAT活力分別提高了9.09%、13.41%、13.90%，SOD活力分別提高了31.82%、38.30%、37.66%?？傮w來說，蕨菜提取液對GSH-Px的抗氧化性抑制最為明顯，SOD次之，對CAT抑制作用微弱。

圖1 4種蕨菜提取液對線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力的影響注：設(shè)對照組為100%，其他組的值與對照組相比得到相對值。下同。與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)；■與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)；▲與空白組相比，差異顯著(P<0.05)；■與▼相比，差異顯著(P<0.05)，?與◆相比，差異顯著(P<0.05)；與空白組相比，差異顯著(P<0.05)；◆與空白組相比，差異顯著(P<0.05)

2.2 秀麗隱桿線蟲細(xì)胞體內(nèi)ROS含量分析

圖2 4種蕨菜提取液對線蟲體內(nèi)ROS含量的影響注：與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)；▲與空白組相比，差異顯著(P<0.05)；▲與相比，差異顯著(P<0.05)；●與相比，差異顯著(P<0.05)，■與●相比，差異顯著(P<0.05)

如圖2所示，與對照組相比，4組不同蕨菜提取液處理的線蟲體內(nèi)ROS含量均明顯升高，其中腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量顯著升高101.4%(P<0.01)，新鮮0.2g/mL組、新鮮1.0g/mL組、腌制1.0g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量分別升高了22.9%、34.5%、67.8%(P<0.05)；與新鮮1.0g/mL組相比，新鮮0.2g/mL組、腌制1.0g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量分別下降了44.9%、33.3%(P<0.05)，腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量升高33.6%(P<0.05)；與新鮮0.2g/mL組相比，新鮮1.0g/mL組、腌制0.2g/mL組、腌制1.0g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量分別升高了44.9%、78.5%、11.6%。以上結(jié)果說明，各蕨菜提取液使得線蟲體內(nèi)的ROS含量均顯著增加，腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量顯著增加。

2.3 秀麗隱桿線蟲體內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響分析

由于DNA斷裂而增加的凋亡細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色處理后呈現(xiàn)黃色或橙色，正常細(xì)胞呈綠色，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到明顯的綠色正常細(xì)胞，綠光強(qiáng)度越來越弱即秀麗隱桿線蟲體內(nèi)正常細(xì)胞越來越少，凋亡細(xì)胞越來越多。與對照組相比，新鮮組和腌制組的綠光強(qiáng)度均弱于對照組，即對照組的綠光強(qiáng)度最強(qiáng)；對新鮮蕨菜組，圖3B-1的綠光強(qiáng)度強(qiáng)于圖3B-2；對腌制蕨菜組，圖3C-2的綠光強(qiáng)度強(qiáng)于圖3C-1；新鮮組與腌制組相比，圖3B-1的綠光強(qiáng)度強(qiáng)于圖3C-1，圖3C-2的綠光強(qiáng)度強(qiáng)于圖3B-2，而圖3B-1的綠光強(qiáng)度和圖3C-2的綠光強(qiáng)度、圖3B-2的綠光強(qiáng)度和圖3C-1的綠光強(qiáng)度無明顯差別。由此可知，蕨菜提取液對線蟲細(xì)胞有凋亡作用，對新鮮組其蕨菜提取液濃度升高，其綠光強(qiáng)度變?nèi)?；對腌制組其蕨菜提取液濃度升高，其綠光強(qiáng)度變強(qiáng)；新鮮1.0g/mL組和腌制 0.2g/mL對線蟲有明顯凋亡作用，新鮮0.2g/mL組和腌制 1.0g/mL對線蟲細(xì)胞的凋亡作用弱于前者。

圖3A(空白對照)

圖3B-1(新鮮0.2g/mL)

圖3B-2(新鮮1.0g/mL)

圖3C-1(腌制 0.2g/mL)

圖3C-2(腌制1.0g/mL)

3 討論

3.1 不同組分蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT三種抗氧化酶活力影響

3種氧化酶GSH-Px、SOD、CAT都是在抗氧化性方面極為重要的抗氧化劑，在清除自由基、延緩衰老、抗氧化、提高免疫力等方面有重要作用，可以在適當(dāng)程度反映物質(zhì)對人體的健康影響。從本實驗結(jié)果來看，各組蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)3種抗氧化酶活力存在抑制。先前研究顯示，蕨菜中含有類黃酮和多糖類物質(zhì)，類黃酮和多糖類物質(zhì)均有抗氧化作用，當(dāng)多糖濃度為800μg/mL時的DPPH自由基清除率可達(dá)83.1%[21]。 但從3種酶的活性分析結(jié)果和ROS測定結(jié)果來說，線蟲體內(nèi)酶活性受到抑制并且其ROS含量明顯升高，蕨菜中此類物質(zhì)的作用并未見到效果。結(jié)合細(xì)胞凋亡的結(jié)果分析，蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)3種抗氧化酶在清除自由基、發(fā)揮抗氧化酶活性方面表現(xiàn)出消極作用，即4種蕨菜提取液抑制抗氧化性的效果較明顯。從酶的抗氧化性角度分析，本實驗影響線蟲體內(nèi)酶抗氧化性的因素很多：一是內(nèi)在因素，蕨菜中本身含有抗氧化性物質(zhì)可促進(jìn)抗氧化酶發(fā)揮作用，但結(jié)果表明酶活性受到抑制，說明蕨菜提取液中存在抑制酶活性的物質(zhì)，這種物質(zhì)或抑制了蕨菜中的抗氧化性物質(zhì)的表達(dá)或作用強(qiáng)于蕨菜中的抗氧化性物質(zhì)而使得酶活性最終受到抑制；二是外在因素，本實驗對蕨菜進(jìn)行了腌制，腌制蕨菜中所含的亞硝酸鹽等具有氧化性，一定程度上對線蟲體內(nèi)的抗氧化酶造成影響。這兩方面也能解釋為何本實驗中腌制1.0g/mL組處理的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD、CAT的活性略高于對照組，可以對此做深入研究，從而更為準(zhǔn)確地判定蕨菜提取液對這3種酶的作用機(jī)制和影響結(jié)果。

3.2 不同組分蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲細(xì)胞體內(nèi)ROS含量的影響

研究表明，ROS可通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致氧自由基及脂質(zhì)分解物等有毒物質(zhì)的產(chǎn)生以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死，并且高濃度的ROS具有細(xì)胞毒作用，也會引起細(xì)胞凋亡、壞死[22]。本實驗中各組蕨菜提取液濃度處理的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS含量都比對照組高，其中腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量達(dá)到最高，新鮮1.0g/mL組次之，新鮮0.2g/mL組和腌制1.0g/mL組含量又低于前兩組。通過細(xì)胞調(diào)亡試驗可以證明，各組蕨菜提取液濃度對線蟲細(xì)胞有明顯凋亡作用，且新鮮0.2g/mL組和腌制1.0g/mL組的凋亡程度明顯低于另兩組，這與ROS含量測定結(jié)果對應(yīng)，即ROS含量增加，對細(xì)胞有危害作用并誘導(dǎo)其凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。再結(jié)合3種酶的活性分析，新鮮0.2g/mL組酶活抑制性弱于新鮮1.0g/mL組，且前者細(xì)胞ROS含量也低于后者；但對腌制組來說，雖然腌制0.2g/mL組酶活抑制性強(qiáng)于腌制1.0g/mL組且前者細(xì)胞ROS含量高于腌制1.0g/mL后者，但腌制0.2g/mL組酶活抑制性并非最強(qiáng)，其線蟲細(xì)胞的ROS含量卻為最高，從筆者上文對3種酶活性的分析討論看，是由于各種因素對酶活性的影響而造成的結(jié)果，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步試驗論證。但本實驗可以明確得出，蕨菜提取液對線蟲體內(nèi)細(xì)胞的ROS含量有明顯提高作用。

3.3 不同濃度蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲細(xì)胞凋亡的影響

由本實驗細(xì)胞凋亡結(jié)果可知，蕨菜提取液可以導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生非正常的機(jī)體凋亡。各組蕨菜提取液濃度處理的秀麗隱桿線蟲與對照組相比，其凋亡程度均大于對照組，其中新鮮0.2g/mL組的秀麗隱桿線蟲的凋亡程度低于新鮮1.0g/mL組；腌制0.2g/mL組的秀麗隱桿線蟲的凋亡程度低于腌制1.0g/mL組；對新鮮組來說，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的細(xì)胞凋亡程度與蕨菜水提取液濃度呈正相關(guān)，但對腌制組來說，則相反。從先前ROS含量測定結(jié)果來說，各組蕨菜提取液濃度處理的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS含量均明顯升高，且其細(xì)胞ROS含量的高低與細(xì)胞凋亡程度大致對應(yīng)，可以測面證實線蟲細(xì)胞的凋亡。本實驗中難以判斷新鮮0.2g/mL組和腌制1.0g/mL組凋亡程度的大小及新鮮1.0g/mL組和腌制0.2g/mL組凋亡程度的大小；從ROS含量測定結(jié)果來說，新鮮0.2g/mL組和腌制1.0g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量分別小于新鮮1.0g/mL組和腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量，前兩者細(xì)胞內(nèi)自由基含量少于后兩者，相對而言對細(xì)胞造成的損傷稍小；結(jié)合3種抗氧化酶活性的測定結(jié)果來說，新鮮0.2g/mL組和腌制1.0g/mL組線蟲體內(nèi)3種抗氧化酶活性分別低于新鮮1.0g/mL組和腌制0.2g/mL組，這使得二者的作用相互碰撞或抑制，其機(jī)理尚未明確不能妄下斷論，可作為新的研究方向。言而總之，蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲的這種推動非正常細(xì)胞凋亡的作用，對秀麗隱桿線蟲本身而言是具有危害的。

4 結(jié)論

本文研究了不同蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化特性的影響，結(jié)果顯示，不論是新鮮態(tài)蕨菜提取液還是腌制態(tài)蕨菜提取液都對秀麗隱桿線蟲抗氧化性和細(xì)胞凋亡機(jī)制有消極影響。但蕨菜提取液成分復(fù)雜，自由基及細(xì)胞凋亡的影響因素眾多，本文未能明確蕨菜影響抗氧化酶活和ROS的具體機(jī)理，后期可以做進(jìn)一步的研究?！?/p>