石麗麗，韓 超，趙金鵬，李 巖

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京 100050)

蝦青素是一種在自然界中廣泛存在的天然抗氧化劑，其分子結(jié)構(gòu)中具有很長的共軛雙鍵鏈以及不飽和的酮基和羥基，能夠有效清除自由基和淬滅活性氧，使其具有較強(qiáng)的抗氧化活性[1]。研究表明，蝦青素還具有增強(qiáng)免疫力、抗炎抗感染、抑制腫瘤、降血糖、預(yù)防心血管疾病以及預(yù)防老年癡呆等多種有益作用[2-5]。因此，蝦青素在營養(yǎng)保健食品、食品添加劑和醫(yī)藥產(chǎn)品等多個(gè)領(lǐng)域均具有廣闊的市場前景。本研究采用急性毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)、大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)等毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法，旨在對(duì)蝦青素的食用安全性進(jìn)行評(píng)估，為蝦青素產(chǎn)品在保健食品和食品添加劑等領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

受試物：蝦青素軟膠囊的內(nèi)容物為紅棕色油狀液體，人體推薦量為1g/d，即每天0.016 7g/kg·BW(成人按60kg體重計(jì))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料條件

SD大鼠(SPF級(jí))、昆明種小鼠(SPF級(jí))均購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK-(軍)2012-0004。飼養(yǎng)地點(diǎn)為中國疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物房和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物房，許可證號(hào)為SYXK(京)2014-0043、SYXK(京)2013-0019，實(shí)驗(yàn)室為屏障環(huán)境，溫度20～24℃，相對(duì)濕度40%～70%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)前在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)3d。

1.3 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株為鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 健康SD大鼠20只，雌雄各半，體重180～220g，采用最大耐受量(MTD)法。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物隔夜空腹(禁食16h，不限制飲水)，以樣品原液直接灌胃給予動(dòng)物，樣品的質(zhì)量體積比為0.950g/mL，以10.0mL/kg·BW灌胃量進(jìn)行灌胃，灌胃2次，受試物給予劑量為19.0g/kg·BW。觀察期14d，記錄動(dòng)物中毒癥狀及死亡情況。

1.4.2Ames試驗(yàn) 采用平板摻入法，使用鑒定合格的TA97、TA98、TA100、TA102菌株，S9混合液為體外代謝活化系統(tǒng)。稱取受試物1.0g，以0.103MPa、20min高壓滅菌后，加滅菌DMSO定容至20mL，濃度為5 000μg/皿，作為最高劑量組。試驗(yàn)劑量為5 000、1 000、200、40、8μg/皿，另設(shè)空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和陽性對(duì)照組，陽性物包括2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、1，8-二羥基蒽醌和敵克松，每個(gè)組別設(shè)3個(gè)平行皿。此試驗(yàn)重復(fù)2次，若受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照組的2倍以上，且具有劑量反應(yīng)關(guān)系者則為陽性。

1.4.3小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 選用昆明小鼠50只，體重25～30g。實(shí)驗(yàn)按照一次性最大灌胃劑量方法進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)，3個(gè)劑量組分別為2.38、4.75、9.50g/kg·BW，另設(shè)陰性對(duì)照組和環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組(40mg/kg·BW)。采用間隔24h兩次經(jīng)口灌胃法進(jìn)行試驗(yàn)，按10mL/kg·BW灌胃，第二次給予受試物6h后頸椎脫臼處死動(dòng)物，取胸骨骨髓制片。每只小鼠計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值(PCE/NCE)；并觀察1 000個(gè)PCE中含微核的細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)微核發(fā)生率。

1.4.4小鼠精子畸形試驗(yàn) 選用健康性成熟雄性昆明小鼠30只，體重25～35g。按照一次性最大灌胃劑量方法進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)，3個(gè)受試物劑量組分別為2.38、4.75、9.50g/kg·BW，另設(shè)溶劑對(duì)照組和環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組(40mg/kg·BW)。灌胃量為10mL/kg·BW，連續(xù)5d給予受試物。實(shí)驗(yàn)第35天，頸椎脫臼處死小鼠，取兩側(cè)附睪精子濾液制片、鏡檢。每只小鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)精子，并計(jì)算精子畸形率。

1.4.5大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn) 選用健康斷乳SD大鼠80只，設(shè)對(duì)照組和3個(gè)劑量組，每組20只，雌雄各半。根據(jù)樣品的人體推薦量設(shè)立3個(gè)劑量組，分別為0.418、0.835、1.670g/kg·BW，灌胃量為4mL/kg·BW。稱取41.75g受試物，食用植物油定容至100mL作為高劑量組，中、低劑量組依次以食用植物油2倍倍比稀釋，各劑量組終濃度分別為417.5、208.8、104.4mg/mL。對(duì)照組灌胃給予相同體積的食用植物油。試驗(yàn)期間，每天觀察并記錄動(dòng)物的生長狀況，每周稱2次體重，記錄每周進(jìn)食量并計(jì)算食物利用率。30d后麻醉腹主動(dòng)脈取血檢測血液學(xué)和血液生化學(xué)檢查。對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，肝、腎、脾和睪丸(卵巢)進(jìn)行稱重，計(jì)算臟體比。對(duì)照組和高劑量組的肝、腎、脾、胃、十二指腸和睪丸(卵巢)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，微核試驗(yàn)采用泊松分布檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，精子畸形試驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)，大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)采用方差分析，以α=0.05作為顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)

蝦青素以19.0g/kg·BW劑量灌胃給予大鼠，14d內(nèi)未見實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)中毒癥狀和死亡情況，表明蝦青素對(duì)雌、雄兩種性別的大鼠的急性毒性最大耐受劑量均大于19.0g/kg·BW，屬于無毒級(jí)。

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Ames試驗(yàn)在加S9與不加S9的情況下，各實(shí)驗(yàn)組在相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)2次，結(jié)果表明，蝦青素各劑量組的回變菌落數(shù)都未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量反應(yīng)關(guān)系。因此，蝦青素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102不具有致突變作用。

2.2.2小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 與陰性對(duì)照組相比，蝦青素各劑量組嗜多染紅細(xì)胞(PCE)與成熟紅細(xì)胞(NCE)的百分比并未低于20%，說明在此實(shí)驗(yàn)劑量下蝦青素未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。與陰性對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺陽性組的微核率顯著升高(P<0.01)，而各劑量組的微核率并未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果表明，蝦青素對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞未產(chǎn)生致突變作用(表1)。

表1 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

注：與陰性對(duì)照組相比，* *P<0.01

2.2.3小鼠精子畸形試驗(yàn) 與陰性對(duì)照組相比，蝦青素各劑量組的精子畸形率無顯著性差異(P>0.05)，而環(huán)磷酰胺陽性組與陰性對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.01)，說明蝦青素對(duì)小鼠精子無致畸作用(表2)。

表2 精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

注：與陰性對(duì)照組相比，* *P<0.01

2.3 大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)

2.3.1生長狀況及食物利用率 實(shí)驗(yàn)期間，各組動(dòng)物活動(dòng)正常，無明顯中毒癥狀，生長發(fā)育良好。與對(duì)照組相比，各劑量組動(dòng)物體重、增重、進(jìn)食量和食物利用率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠體重、食物總攝入量和食物利用率的影響

注：與對(duì)照組相比，P>0.05

2.3.2血液學(xué)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，各劑量組血液學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較，1.670g/kg·BW劑量組雌性大鼠單核細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)，但此指標(biāo)的差異在本實(shí)驗(yàn)室對(duì)照組歷史正常檢測范圍內(nèi)，且劑量組之間無劑量反應(yīng)關(guān)系，因此上述差異無生物學(xué)意義，其余各劑量組血液學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組相比均無顯著性差異(P>0.05)(表4～5)。

表4 蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠血液學(xué)的影響

注：與對(duì)照組相比，P>0.05

2.3.3血液生化指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，各劑量組血液生化指標(biāo)與對(duì)照組比較，0.418g/kg·BW劑量組雄性大鼠總蛋白含量顯著升高(P<0.05)，但此指標(biāo)的變化在實(shí)驗(yàn)室對(duì)照組歷史正常檢測范圍內(nèi)，該指標(biāo)的升高無生物學(xué)意義。0.835g/kg·BW和1.670g/kg·BW劑量組雌性大鼠甘油三酯含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，該指標(biāo)的

降低無生物學(xué)意義。其余各劑量組血生化檢測結(jié)果與對(duì)照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表6～7)。

2.3.4對(duì)大鼠臟器重和臟體比的影響 各劑量組大鼠臟器重肝、脾、腎、睪丸(卵巢)及實(shí)驗(yàn)?zāi)┛崭贵w重，臟體比肝/體、脾/體、腎/體、睪丸(卵巢)/體和陰性對(duì)照組比較均無顯著性差異。

2.3.5組織病理學(xué)檢查 對(duì)照組和高劑量組進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，個(gè)別動(dòng)物的肝臟中發(fā)現(xiàn)輕度肝細(xì)胞脂肪變性(對(duì)照組4/20例、高劑量組4/20例)，小灶性炎細(xì)胞浸潤(對(duì)照組4/20例、高劑量組2/20例)，腎臟出現(xiàn)局灶性腎小管再生(對(duì)照組1/20例、高劑量組0/20例)、腎臟內(nèi)局灶性纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤(對(duì)照組1/20例、高劑量組0/20例)，以上肝臟和腎臟的病理學(xué)改變是動(dòng)物常見自發(fā)病變，并且高劑量組的病變發(fā)生率與對(duì)照組無顯著性差異，因此該病變和受試物無關(guān)。其余臟器包括脾、胃及十二指腸、睪丸和卵巢未發(fā)現(xiàn)明顯異常。因此，與對(duì)照組比較，蝦青素并未引起動(dòng)物肝、腎、脾、胃及十二指腸、睪丸(卵巢)的病理學(xué)改變。

表5 蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠白細(xì)胞分類的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

表6 蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討論

蝦青素廣泛存在于水生動(dòng)物體中，人類日常食用的甲殼類和魚類等水產(chǎn)品中的蝦青素含量最高[6-7]。人類的日常食物中含有大量的蝦青素，攝入天然食物中的蝦青素是安全的，而對(duì)于提取濃縮和加工合成的蝦青素還有待進(jìn)一步研究。近年來，人們對(duì)商品化的蝦青素產(chǎn)品的安全性也逐漸開展了相關(guān)的毒理學(xué)研究。劉敏等[8]研究蝦青素粉末制劑的急性毒性和遺傳毒性作用，結(jié)果表明，小鼠的經(jīng)口LD50>1g/kg·BW，蝦青素屬于無毒級(jí)，并未見遺傳毒性作用。曲見松等[9]對(duì)蝦青素軟膠囊(油溶制劑)的遺傳毒性進(jìn)行研究，也未發(fā)現(xiàn)具有遺傳毒性。陳燕[10]對(duì)蝦青素相關(guān)的功能產(chǎn)品“蝦青素人參當(dāng)歸茶葉軟膠囊”進(jìn)行了安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)，該產(chǎn)品在急性毒性、遺傳毒性和30d喂養(yǎng)試驗(yàn)中無明顯毒副作用。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)蝦青素軟膠囊開展毒性研究，結(jié)果表明，蝦青素軟膠囊對(duì)雌、雄大鼠的急性經(jīng)口最大耐受量(MTD)均大于19.0g/kg·BW。Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)結(jié)果均未見該樣品有致突變作用。大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)正常，無明顯中毒癥狀，生長發(fā)育良好，各劑量組動(dòng)物體重、進(jìn)食量、食物利用率、血液學(xué)、血生化、臟器重量以及臟體比均未見異常，病理檢查也未見由受試物引起的異常改變。因此，在本實(shí)驗(yàn)條件下蝦青素未見明顯毒副作用，為蝦青素作為保健食品的研究開發(fā)提供了重要的毒理學(xué)科學(xué)依據(jù)?！?/p>

表7 蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05