苗景 何祥波 許錦聰 林仕欣 梁學(xué)武

摘要：靈芝多糖（GLP）是靈芝中主要功能性活性成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖和降血脂等功效。采用大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠乳腺炎，研究靈芝多糖對小鼠乳腺炎的保護(hù)作用。試驗(yàn)選取剛分娩的健康雌性小鼠75只，分為空白對照組、LPS組、LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組，LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組、LPS+8%GLP組分別灌胃2%、4%、8%的靈芝多糖溶液，空白對照組和LPS組灌胃等量的生理鹽水。注射LPS后，測量小鼠體溫變化，24 h后取乳腺制作石蠟組織切片，并測定乳腺中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量和MPO活性。結(jié)果表明，與空白對照組相比，LPS組小鼠體溫變化顯著，乳腺組織切片出現(xiàn)明顯的中性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，IL-1β、IL-6、TNF-α含量和MPO活性顯著上升;LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組、LPS+8%GLP組與LPS組相比，小鼠體溫變化有顯著改善，18 h后LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組與LPS組差異顯著（P<0.05）;與LPS組相比，LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組、LPS+8%GLP組小鼠乳腺中性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯減輕，LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組的TNF-α、IL-1β含量顯著低于LPS組（P<0.05）;LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組中IL-6含量顯著低于LPS組（P<0.05），LPS+2% GLP組與LPS組差異不顯著（P>0.05）。上述結(jié)果表明，添加4%、8%靈芝多糖可以減輕由LPS引起的小鼠乳腺炎反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：小鼠;靈芝多糖;脂多糖;乳腺炎

中圖分類號： S853.74 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0197-04

梁學(xué)武，教授，主要從事反芻動物營養(yǎng)與生產(chǎn)研究，E-mail：faulxw2000@163.com。 奶牛乳房炎是奶牛場常見的疾病之一，是奶牛健康養(yǎng)殖中極具挑戰(zhàn)性的難題。乳腺炎是由病原微生物感染、理化因素刺激等引起的一種炎癥反應(yīng)。其中病原微生物感染是導(dǎo)致乳房炎的主要因素，研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌是引發(fā)乳腺炎的主要環(huán)境性致病菌。脂多糖（LPS）是大腸桿菌細(xì)胞壁外膜主要成分，可通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等合成和釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)乳腺炎[1-2]。奶牛乳腺炎是生產(chǎn)中普遍存在的問題，可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。使用奶牛進(jìn)行試驗(yàn)成本高，且操作復(fù)雜，小鼠具有成本低、操作簡單、重復(fù)性好和易于管理等優(yōu)點(diǎn)，因此國內(nèi)外常使用小鼠作為乳腺炎研究的動物模型[3-6]。

臨床上多采用抗生素方法治療乳腺炎，但存在細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、食品及生態(tài)安全風(fēng)險等諸多弊端，且復(fù)發(fā)率較高[7]。使用抗生素防治乳腺炎風(fēng)險逐漸顯現(xiàn)，尋找新的無毒無抗、綠色安全的替代制劑越來越迫切[8]。靈芝多糖（GLP）是靈芝中重要的生物活性成分，具有增強(qiáng)動物機(jī)體免疫功能，提高中性粒細(xì)胞吞噬和殺菌能力的作用，同時具有降低組織損傷程度的功效[9]。本研究通過灌胃給予小鼠靈芝多糖，對小鼠乳房注射脂多糖建立乳房炎模型，通過分析表觀癥狀和病理學(xué)表現(xiàn)及相關(guān)免疫因子的表達(dá)情況，研究靈芝多糖對小鼠乳腺炎的保護(hù)作用，為大腸桿菌性奶牛乳腺炎的預(yù)防研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為120只雌性和30只雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為18～20 g，購自福建中醫(yī)藥研究院。小鼠自由采食和飲水，試驗(yàn)溫度為24±1 ℃，相對濕度為40%～80%。

1.2 試劑

靈芝多糖購自吾靈（福州）生物科技有限公司，含量為30.1%;LPS（大腸桿菌055：B5）購自西格瑪化學(xué)公司。髓過氧化物酶（MPO）活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 小鼠分組及給藥方案

試驗(yàn)用小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將雄鼠和雌鼠按1 ∶ 4比例合籠飼養(yǎng)，使雌鼠受孕，密切觀察小鼠的生長情況，并在受孕第14天摸胎確認(rèn)懷孕鼠，納入后期試驗(yàn)。再選取泌乳為 1～2 d，體表健康，乳區(qū)無損傷，質(zhì)量為40 g左右的初產(chǎn)小鼠75只。將75只小鼠均分為5組，分別為空白對照組、LPS組、LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組、LPS+8% GLP組。LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組分別灌胃 0.4 mL 2%、4%、8%的靈芝多糖溶液，空白對照組和LPS組灌胃等量的生理鹽水。試驗(yàn)期為17 d。每天08：00灌胃1次，最后1次灌胃1 h后LPS組、LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組注射LPS溶液。注射LPS 24 h后脫頸處死小鼠。

1.4 乳腺炎模型

使用10%水合氯醛對小鼠進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉后，在第4對乳頭及周圍區(qū)域用75%乙醇消毒，用無菌手術(shù)剪剪除乳頭1 mm左右。使用帶有32 g針頭的微量注射器在第4對乳頭處各注射0.2 mg/mL LPS溶液50 μL。

1.5 樣品采集與處理

注射LPS后，在0、6、12、18、24 h連續(xù)測定各組小鼠體溫并記錄。試驗(yàn)結(jié)束后小鼠禁食、不禁水過夜，乙醚吸入麻醉，稱質(zhì)量，摘眼球采集血液，測定小鼠乳腺M(fèi)PO活性、TNF-α含量、IL-1β含量和IL-6含量等指標(biāo)。取小鼠右側(cè)乳腺，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后，制作石蠟切片，采用顯微鏡觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖對小鼠狀態(tài)及體溫的影響

如表1所示，在LPS注射6 h后，LPS組小鼠體溫最低，為37.07 ℃，與其他組相比差異顯著（P<0.05），LPS+GLP組小鼠體溫顯著低于空白對照組（P<0.05），LPS+8%組小鼠體溫顯著高于LPS+2%組（P<0.05），與LPS+4%組差異不顯著（P>0.05）;在LPS注射后12 h時，LPS組和LPS+GLP組小鼠體溫上升，LPS組和LPS+2% GLP組小鼠體溫顯著高于其他組（P<0.05），LPS+8% GLP組小鼠體溫顯著高于空白對照組（P<0.05），與GLP+4%組差異不顯著（P>0.05）。在LPS注射18、24 h時，各組之間體溫差異顯著（P<0.05），其中LPS組小鼠體溫最高，分別為39.06、39.43 ℃，空白對照組體溫最低，分別為37.60、37.63 ℃。

2.2 小鼠乳腺組織的變化

如圖1所示，與對照組相比，LPS組的乳腺病理變化最為嚴(yán)重，乳腺腺泡中呈現(xiàn)水腫現(xiàn)象，腺泡結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞。LPS+GLP 組乳腺細(xì)胞出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤，乳腺的病理變化較輕。組織病理學(xué)切片結(jié)果表明，靈芝多糖在一定程度上可有效緩解LPS誘發(fā)的乳腺炎。

2.3 靈芝多糖對LPS刺激小鼠乳腺組織中MPO活性的影響

如表2所示，LPS組乳腺組織中MPO活性顯著高于空白對照組（P<0.05），表明LPS可成功誘導(dǎo)小鼠乳腺炎癥。LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組乳腺組織中MPO活性顯著低于LPS組（P<0.05），表明靈芝多糖可以抑制小鼠乳腺組織中MPO的產(chǎn)生。

2.4 靈芝多糖對LPS刺激小鼠乳腺組織中主要炎性因子的影響

如表3所示，與空白對照組相比，LPS組小鼠乳腺組織中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高（P<0.05），LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組的TNF-α、IL-1β含量顯著低于LPS組（P<0.05）;LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組中 IL-6含量顯著低于LPS組（P<0.05），LPS+2% GLP組IL-6含量與LPS組差異不顯著（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

炎癥是機(jī)體對各種致炎因子及局部損傷所產(chǎn)生的防御性反應(yīng)。臨床上，炎癥局部可產(chǎn)生紅、腫、熱、痛及功能障礙，并伴有不同程度的全身反應(yīng)。發(fā)熱是LPS感染的主要反應(yīng)之一，引起動物發(fā)熱的致熱源一般分為2類：一類是由宿主產(chǎn)生和釋放的內(nèi)源性致熱源，另一類則是由微生物產(chǎn)生的外源性致熱源[10]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6和TNF-α都屬于內(nèi)源性致熱源[11]。注射LPS后， 小鼠出現(xiàn)精神萎靡不振、 反應(yīng)遲鈍、活動明顯減少的表現(xiàn)，同時乳腺出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，這和Roches等在奶牛上的觀察結(jié)果一致[12]。小鼠感染LPS后，體溫呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，總體在24 h時溫度達(dá)到最高值。劉萍等的試驗(yàn)結(jié)果[10-11]與此相同。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁表面主要的毒力因子，是引起大腸桿菌性乳腺炎的主要原因。當(dāng)LPS進(jìn)入乳腺組織中時，會引起大量的中性細(xì)胞聚集。中性粒細(xì)胞的生理作用直接消滅突破了第1道免疫屏障的入侵抗原，當(dāng)中性粒細(xì)胞檢測到抗原或接收到來自組織細(xì)胞的信號時，便會大量流入組織[13]。進(jìn)入乳腺組織中的中性粒細(xì)胞在吞噬抗原的同時，也會導(dǎo)致部分乳腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度的萎縮，甚至遭到破壞[14]。Merriman等研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺炎發(fā)病期間，嗜中性粒細(xì)胞幾乎占了總體細(xì)胞的90%[15]。本試驗(yàn)中，LPS組乳腺組織出現(xiàn)明顯的水腫和中性粒細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。

LPS通過Toll樣受體4（TLR4）傳遞信號，經(jīng)過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式進(jìn)一步激活下游的炎癥信號通路NF-κB和MAPKs，產(chǎn)生炎癥因子、黏附分子、趨化因子、生長因子和環(huán)氧化酶等炎癥介質(zhì)，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)[16-17]。IL-1β是白細(xì)胞介素家族的重要成員之一，可通過誘導(dǎo)機(jī)體釋放大量炎性細(xì)胞因子來引起炎癥瀑布反應(yīng)[18]。TNF-α是一種高度促炎性的細(xì)胞因子，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的活化以及白細(xì)胞向感染部位的募集和活化。據(jù)報道，使用大腸桿菌感染乳腺可大大增加血液和牛奶中的TNF-α含量[19]。IL-6由2型輔助（Th2）細(xì)胞分泌，可參與先天性和獲得性免疫各個方面的調(diào)節(jié)。Alhussien等使用大腸桿菌刺激乳腺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6表達(dá)量顯著增加[19]。研究發(fā)現(xiàn)，使用LPS刺激小鼠，可使機(jī)體中的IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞炎性因子含量急劇增加[20-21]。在本研究中，LPS組小鼠體溫變化明顯，乳腺腺泡中呈現(xiàn)水腫和明顯的中性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，與空白對照組相比，乳腺中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量和MPO活性呈顯著增加，表明LPS成功誘導(dǎo)小鼠乳腺產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

靈芝多糖（GLP）是靈芝中主要生物活性成分，具有抗菌、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血糖和降血脂等功效[22-23]。Skalicka-Wo z′niak等研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖具有抑菌能力，對藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黑曲霉菌和黑根霉菌具有較高的抑制能力[24-25]。GLP對先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力。GLP能夠顯著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A和IL-4的分泌，緩解由葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘發(fā)的結(jié)腸炎，維持腸道的穩(wěn)態(tài)[26]。余鈺驄等研究發(fā)現(xiàn)，靈芝結(jié)構(gòu)多糖水解單體GLSP1和GLSP2可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖，減弱其吞噬功能，并下調(diào)LPS激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO和TNF-α的水平[27]。江國勇等在丙烯酰胺小鼠模型中，使用黑靈芝多糖灌胃小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖可顯著降低小鼠肝臟中的IL-1β和IL-10水平，改善丙烯酰胺造成的肝臟損傷[28]。在本研究中，靈芝多糖通過抑制乳腺組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，顯示出抗炎作用。病理組織學(xué)切片觀察結(jié)果表明，靈芝多糖可減輕大腸桿菌內(nèi)毒素引起的病理損傷。此外，在靈芝多糖濃度為2%、4%和8%時，乳腺中的MPO活性水平顯著降低。這些結(jié)果表明，靈芝多糖可緩解由大腸桿菌感染引起的乳腺炎癥反應(yīng)。