史俊 楊鶴同 徐超 席剛俊 趙菊潤

摘要：以鐵皮石斛為材料，設(shè)置Na2CO3（50 mmol/L）脅迫和外源水楊酸（SA）處理（0～5 mmol/L）試驗，通過測定鐵皮石斛各項生理指標，研究水楊酸（SA）對鐵皮石斛幼苗耐鹽堿性的效應(yīng)。結(jié)果表明，在Na2CO3脅迫環(huán)境下，隨時間延長，鐵皮石斛可提高有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白、脯氨酸）含量和抗氧化保護酶（過氧化岐化酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶）活性應(yīng)對脅迫，不同濃度水楊酸均可進一步提升各項生理指標水平，保證葉綠素的正常合成和根系活力，降低細胞膜質(zhì)過氧化傷害，提高鐵皮石斛抗鹽堿的能力，綜合來看，以噴施3.0 mmol/L SA效果最佳。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;抗鹽堿性;水楊酸;生理指標;有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì);抗氧化保護酶

中圖分類號： S567.23+9.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0176-05

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科石斛屬多年生草本植物，屬國家二級保護植物，具有益胃生津、滋陰清熱、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等功效[1-4]。由于長期毀滅性采挖與生存環(huán)境破壞，野生資源瀕臨滅絕，通過人工手段繁殖和栽培鐵皮石斛是滿足市場需求和保護野生鐵皮石斛資源的主要手段。目前，全球氣候不斷變暖，土壤鹽堿化越來越嚴重，水體鹽堿性也越來越嚴重，pH值偏高，鐵皮石斛栽培雖多采用無土栽培，不與土壤直接接觸，但灌溉用水一般采用地表水或地下水直接澆灌，水源中較高的鹽堿性常常會阻礙鐵皮石斛生長，造成僵苗或?qū)е滤劳?。因此，研究鐵皮石斛的耐鹽堿機理及提高其抗鹽堿性的措施，對鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)化生產(chǎn)有重要的意義。

水楊酸（SA）是植物體內(nèi)的一種小分子酚類化合物，也是一種重要的內(nèi)源激素，參與植物的多種生理活動的調(diào)節(jié)[5]，對植物抗逆性具有重要作用[6-7]，是植物系統(tǒng)獲得性抗性的重要誘導因子，以往對SA的研究更多集中在抗病性方面，Raskin研究發(fā)現(xiàn)，SA及其類似物能誘導植物產(chǎn)生抗鹽性狀[8]。近些年來，許多學者研究了SA提高黃瓜、玉米、小麥、蕎麥等多種作物抗鹽性的效果和生理機制[9-14]，但多采用中性鹽進行研究，有關(guān)SA在提高植物抗堿性鹽脅迫方面的研究鮮有報道，因此本研究以鐵皮石斛2年生幼苗為材料，通過噴施不同濃度SA，研究SA對堿性鹽（Na2CO3）脅迫下鐵皮石斛葉綠素、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性蛋白含量，保護酶活性及根系活力等生理指標的影響，為選擇適宜濃度的水楊酸、提高鐵皮石斛抗鹽堿性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鐵皮石斛組培苗溫室中盆栽種植1年，選擇生長一致、株高15 cm左右的組培苗作為試驗材料，由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院中藥材種植基地提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 2016年6月在江蘇農(nóng)博園溫室大棚內(nèi)以50 mmol/L Na2CO3溶液（pH值為10.8）澆灌鐵皮石斛幼苗根部，頻率為1次/d，澆灌結(jié)束分別用不同濃度SA溶液及時均勻噴施葉片正反面，至溶液欲滴為度，SA濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L，即標記為CK、S1、S2、S3、S4、S5，每處理3次重復，每個重復5盆苗。

1.2.2 生理指標測定 分別于處理后0、5、10 d對每個處理隨機選取6株苗，剪取葉片，去除粗大的主葉脈，測定葉綠素、可溶性蛋白、MDA、Pro含量以及超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，剪取根尖測鐵皮石斛根系活力。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[15]，游離Pro、可溶性蛋白含量測定參照高俊鳳[16]的方法，根系活力測定采用TTC法[17]，SOD、POD、CAT、APX活性及葉綠素含量采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA對Na2CO3脅迫下鐵皮石斛葉綠素含量的影響

葉綠素（葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素）含量能夠反映光合作用的能力。由表1可以看出，當用Na2CO3對鐵皮石斛進行脅迫時，SA短時間處理（5 d）的鐵皮石斛葉綠素（葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素）含量出現(xiàn)較大程度的降低，但隨著處理時間的延長，鐵皮石斛葉綠素（葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素）含量有所上升，說明鐵皮石斛對Na2CO3的脅迫有一定的逐步適應(yīng)能力。當用不同濃度SA噴施受脅迫鐵皮石斛苗時，短時間（5 d）可以有效緩解Na2CO3對鐵皮石斛的脅迫，雖然各處理總?cè)~綠素含量分別比處理前低40.9%、6.3%、36.8%、18.6%、17.7%、35.1%，但均高于CK;隨著處理時間的延長（10 d），不同處理中總?cè)~綠素含量出現(xiàn)了分化，但大部分處理低于處理前（0 d）的水平，處理5、10 d時，S3處理總?cè)~綠素含量都達到較大值，與其他處理呈顯著差異，特別是處理10 d時，S3處理總?cè)~綠素含量甚至高于處理前（0 d）的水平。

2.2 水楊酸對Na2CO3脅迫下鐵皮石斛脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白和脯氨酸都是植物體在逆境下調(diào)節(jié)細胞滲透勢的調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠增強植物對逆境的抵抗力。從圖1可知，在SA短時間（5 d）處理下，受脅迫鐵皮石斛可溶性蛋白含量出現(xiàn)了下降，但隨處理時間的延長（10 d），可溶性蛋白含量提高，噴施不同濃度的SA均能有效提高可溶性蛋白含量。處理5 d時，S3處理可溶性蛋白含量達到最高，與其他處理呈顯著差異，繼續(xù)噴施不同濃度SA至10 d時，所有處理可溶性蛋白含量均達到一定水平，各處理間差異不顯著。與可溶性蛋白含量不同，隨著脅迫時間的延長，脯氨酸含量呈現(xiàn)快速上升的趨勢（圖2），噴施不同濃度的SA有利于促進植株體內(nèi)脯氨酸含量的提高，在處理5、10 d時，S3處理的脯氨酸含量都達到最大值，并與CK差異顯著（P<0.05）。

2.3 水楊酸對Na2CO3脅迫下鐵皮石斛MDA含量的影響

MDA作為膜脂過氧化過程中的主要產(chǎn)物之一，其含量的變化可反映細胞膜脂損傷程度。由圖3可知，隨著脅迫時間的延長，植株體內(nèi)MDA含量大體呈現(xiàn)上升趨勢，在同一處理時間內(nèi)，MDA含量隨水楊酸濃度提高大體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在處理5 d時，除S5處理外，其余處理MDA含量均低于對照，其中S3處理MDA含量最低，僅為0.4 μmol/g，與對照和S5處理差異顯著;當處理10 d時，除S1處理，其余處理MDA含量也均低于對照，其中S2和S3處理MDA含量較低。由此可見，S2和S3處理均能有效減輕細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷，提高鐵皮石斛的抗鹽堿性。

2.4 水楊酸對Na2CO3脅迫下鐵皮石斛保護酶活性的影響

植物體內(nèi)存在的SOD、POD、APX、CAT等抗氧化酶系，對清除植物體內(nèi)的過量活性氧、維持活性氧的代謝平衡、防御膜脂過氧化等方面起到積極地作用，SOD是植物體內(nèi)清除活性氧的重要細胞保護酶，其活性反映植物對逆境脅迫的適應(yīng)能力。從圖4可以看出，Na2CO3脅迫下的鐵皮石斛幼苗SOD活性隨處理時間延長呈先上升后略微下降的趨勢;在同一處理時間內(nèi)，SOD活性隨噴施SA的濃度總體呈先上升后下降的趨勢，并且所有處理SOD活性均高于CK。處理5 d時，SOD活性基本達到最大，其中S1和S2處理SOD活性較高，分別比CK高95.9%和159.8%，并與CK差異顯著。說明SA可以提高Na2CO3脅迫下鐵皮石斛葉片中的SOD活性，提高鐵皮石斛的抗鹽堿性。

POD是植物體內(nèi)廣泛存在的一種呼吸酶，一定程度上反映植物的代謝活力。POD活性越高，植株體內(nèi)代謝越旺盛，其抗逆能力就越強。從圖5可以看出，鐵皮石斛受到Na2CO3脅迫初期，POD活性受到了很大抑制，但隨著脅迫時間的延長，鐵皮石斛對Na2CO3脅迫產(chǎn)生一定的適應(yīng)，POD活性有一定的恢復。處理5 d時，所有處理POD活性都高CK，并且S2處理最高，與其他處理差異顯著;處理10 d時，S3處理POD活性達到最高，并與其他處理呈顯著差異。由此可見，噴施一定濃度的水楊酸可以有效解除Na2CO3脅迫時鐵皮石斛POD活性受到的抑制，并在一定程度上提高POD活性。

CAT是植株逆境脅迫下的主要響應(yīng)因子之一。從圖6可以看出，隨著處理時間的延長，CAT活性呈現(xiàn)上升趨勢。處理5 d時，S2處理CAT活性最高，但與CK處理差異不顯著，S4、S5處理CAT活性低于CK;但當處理10 d時，所有處理CAT活性均高于CK，S4處理達到最大值，與其他各處理呈顯著差異。

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關(guān)健酶之一。從圖7可見，Na2CO3脅迫對鐵皮石斛APX活性有較強的抑制作用，并且在較長的處理時間內(nèi)，鐵皮石斛無法有效緩解這種抑制作用，噴施SA后，各處理APX活性均高于CK，并隨著處理時間的延長，各處理APX活性呈上升趨勢，在同一處理時間內(nèi)，APX活性隨SA濃度的提高大體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，S3處理在處理10 d時達到最大，并與其他各處理呈差異顯著。

2.5 水楊酸對Na2CO3脅迫下鐵皮石斛根系活力的影響

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。鐵皮石斛在受到Na2CO3脅迫時，根系活力會受到抑制，結(jié)果如圖8所示。在處理后5 d時，鐵皮石斛所有處理根系活力都出現(xiàn)了下降，其中CK處理根系活力僅為31.64 mg/（g·h），較處理前，根系活力下降了53.5%，其他處理也分別下降了11.0%、7.8%、6.9%、22.8%和3.6%，下降幅度顯著小于CK，但各處理之間無顯著差異;當處理10 d時，CK根系活力得到一定程度的恢復，達到61 mg/（g·h），但仍略低于處理前根系活力，其他處理根系活力均高于處理前，分別提高了42.4%、25.7%、41.3%、21.4%和9.0%，均與CK差異顯著，其中S1和S3處理根系活力較高，分別達到97.0、96.2 mg/（g·h），并與S5處理差異顯著。由此可見，鐵皮石斛在受到Na2CO3脅迫初期，根系活力受到較大的抑制，但隨著脅迫時間的延長，鐵皮石斛的根系逐步適應(yīng)脅迫環(huán)境，根系活力有一定程度的提高，水楊酸有效緩解鐵皮石斛受脅迫初期時根系活力受到的抑制，并在進一步的處理中有提高根系活力的作用。

3 討論

偏堿性水源對鐵皮石斛是鹽害與堿害并存，生長在碳酸鹽條件下，鐵皮石斛除了要忍受Na+脅迫外，還要對抗水中的

高pH值所造成的脅迫，中性鹽脅迫作用并不能代表真實情況?？紤]到上述原因，本試驗通過對堿性鹽（Na2CO3）脅迫下鐵皮石斛噴施不同濃度SA來研究SA對鐵皮石斛Na2CO3的脅迫作用，為鐵皮石斛在鹽堿環(huán)境中成功種植提供參考。

葉綠素作為植物進行光合作用的主要光合色素，其含量的高低與葉片的光合能力和光合潛力密切相關(guān)，因此也通常把葉綠素含量作為葉片功能的一個重要指標[18]。植物在鹽堿處理條件下葉片葉綠素合成前體物質(zhì)的減少，會引起葉綠素a和葉綠素b含量的減少[19]。在本試驗中，鐵皮石斛受到Na2CO3脅迫后，葉綠素含量隨處理時間呈先降低后略微恢復，噴施一定量的SA后，葉綠素含量較對照顯著增加，這與孫德智等的研究結(jié)果[14，20]相吻合。

脯氨酸和可溶性蛋白都是植物體在逆境下調(diào)節(jié)細胞滲透勢的物質(zhì)，能夠增強植物對逆境的抵抗力。鹽脅迫下細胞內(nèi)水勢由于外界離子的作用而升高，為避免細胞失水，植物體內(nèi)會產(chǎn)生脯氨酸和可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以此保證細胞正常吸水。本試驗結(jié)果表明，50 mmol/L Na2CO3脅迫可以促進鐵皮石斛葉片中的Pro和可溶性蛋白含量的提高，噴施SA可以進一步提高其含量，尤其以S3處理效果最好，與黃曉西等的研究結(jié)果[13-14，21]相似，郭慧娟研究發(fā)現(xiàn)，植物體可以通過增加可溶性蛋白含量提高細胞滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強植物對鹽脅迫的適應(yīng)能力[22]。如果說SA作用下Pro和可溶性蛋白含量的升高，有利于鹽堿脅迫下植株滲透能力的提高，那么鹽堿脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的提高就是鐵皮石斛的一種自我保護機制，同時也說明了在短時間內(nèi)，鐵皮石斛對低濃度的鹽堿脅迫具有一定的適應(yīng)能力。由此表明外源SA可以促進鹽堿脅迫下鐵皮石斛植株蛋白質(zhì)的合成，維持植株水分運輸和葉片的光合功能。

植物遭受逆境脅迫時，細胞內(nèi)的活性氧不斷積累，發(fā)生膜脂過氧化，破壞膜結(jié)構(gòu)，影響細胞的正常功能[7]，提高MDA水平。從植物內(nèi)部代謝來看，植物對逆境脅迫的原初反應(yīng)是活性氧代謝，SOD、POD、APX以及CAT是植物體內(nèi)4中重要的抗氧化酶，逆境脅迫中可清除過量的活性氧，緩解膜脂過氧化傷害。本試驗結(jié)果表明，50 mmol/L Na2CO3脅迫提高了鐵皮石斛葉片中SOD和CAT活性，但在脅迫初期會抑制POD和APX活性，隨著脅迫時間的延長，所有抗氧化酶活性都得到了提高，噴施SA進一步提高其活性，并以S3處理抗氧化酶活性最高，葉片中MDA水平總體隨脅迫時間的延長不斷增加，但同一時間內(nèi)，各處理MDA含量變化趨勢與抗氧化酶活性相反，說明SA能有效提高抗氧化酶的活性，清除了細胞中過量的活性氧，緩解了膜脂過氧化的傷害，同時鐵皮石斛在受到Na2CO3脅迫后，根系活力出現(xiàn)了大幅度降低，噴施SA后，鐵皮石斛根系活力得到提高，由此說明SA不但可以通過韌皮部運輸?shù)礁?，還能保護和促進鐵皮石斛根系的生長。

綜上所述，當鐵皮石斛受到一定濃度的鹽堿（Na2CO3）脅迫時，鐵皮石斛可以在一定程度上通過提高有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白、Pro）含量和抗氧化保護酶（SOD、POD、APX、CAT）活性應(yīng)對脅迫，噴施SA可以進一步提升上述物質(zhì)的含量，增強鐵皮石斛應(yīng)對脅迫的能力，保證葉綠素的正常合成和根系活力，顯著降低細胞膜質(zhì)過氧化傷害，從而更有效提高鐵皮石斛抗鹽堿的能力，綜合來看，以噴施3.0 mmol/L SA效果最佳。

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收稿日期：2018-08-23

基金項目：江蘇省高校自然科學基金（編號：16KJB210017）;江蘇省特糧物經(jīng)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-中藥材推廣示范基地建設(shè)項目[編號：JATS（2018）230];江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院院級項目（編號：2018KJ40）。

作者簡介：史 俊（1979—），男，江蘇揚州人，碩士，講師，主要從事藥用植物育種及栽培研究。E-mail：shijun3322@163.com。

通信作者：趙菊潤，高級工程師，主要從事石斛品種選育和栽培研究。E-mail：zjr9296@126.com。