杜云志，馮菁華，常春康

（1.上海金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，上海 201321；2.廣州金域臨床基因組中心，廣東 廣州 510320；3.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院血液科，上海 200233）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes,MDS）是常見(jiàn)的髓系惡性腫瘤，主要特征為克隆性的無(wú)效造血，表現(xiàn)為造血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)異常及外周血中血細(xì)胞減少、重復(fù)出現(xiàn)的遺傳學(xué)改變以及轉(zhuǎn)化為急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,AML）的風(fēng)險(xiǎn)[1]。美國(guó)的腫瘤登記數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)每年的新發(fā)MDS 病例數(shù)＞10 000 例,在65 歲以上的人群中，每10 000 人中新發(fā)病例數(shù)高達(dá)75 例；而歷年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，MDS 的發(fā)病率為（3.6～4.6）例/10 000 人?，F(xiàn)有的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)人群的MDS 發(fā)病年齡早于西方人群[49 歲比（65～73）歲]，同時(shí)我國(guó)人群的MDS 發(fā)病率低于西方人群[2-4]。

MDS 的臨床異質(zhì)性很強(qiáng)，現(xiàn)有的診斷和預(yù)后分層標(biāo)準(zhǔn)在臨床實(shí)踐中還存在一些困難和挑戰(zhàn)。①僅基于形態(tài)學(xué)，有時(shí)很難作出診斷，因?yàn)橛行┎±鄙俚湫偷男螒B(tài)學(xué)改變，而部分形態(tài)學(xué)改變也可能是由于營(yíng)養(yǎng)因素或病毒感染等非MDS 的原因造成的。②在最新的2016 版WHO 淋巴和造血組織惡性腫瘤分類(lèi)中，仍有一類(lèi)暫時(shí)無(wú)法分類(lèi)的型別（MDS-unclassifiable，MDS-U），這些患者的臨床表現(xiàn)與MDS患者類(lèi)似，但其原始細(xì)胞數(shù)目或形態(tài)學(xué)異常的細(xì)胞百分比未達(dá)到MDS 診斷標(biāo)準(zhǔn)，這一組患者仍有可能進(jìn)展為MDS 或AML[1]。③目前，對(duì)于MDS 的預(yù)后評(píng)估主要是基于細(xì)胞遺傳學(xué)，但由于技術(shù)的局限和分辨水平的限制，細(xì)胞遺傳學(xué)不能檢測(cè)出所有的遺傳學(xué)改變，特別是點(diǎn)突變、移碼突變和小的插入和缺失，并且不是所有細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)到的異常都有同樣的診斷學(xué)意義。④目前的診斷流程是先通過(guò)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞儀分析，根據(jù)細(xì)胞遺傳和分子病理的結(jié)果按照現(xiàn)有的分類(lèi)系統(tǒng)將患者劃入MDS、AML、意義未明的特發(fā)性血細(xì)胞減少、意義未明的發(fā)育異常、未知潛能的克隆造血以及意義未明的克隆性細(xì)胞減少[5-6]。而按照現(xiàn)有的診斷流程仍存在不能明確診斷的病例,特別是對(duì)于骨髓中原始細(xì)胞百分比＜5%的病例，缺乏診斷金標(biāo)準(zhǔn)。

在20 世紀(jì)70 年代之前，顯微鏡是診斷血液腫瘤的唯一實(shí)驗(yàn)室工具，人們僅根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)疾病進(jìn)行診斷和分類(lèi)。隨著多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞遺傳和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在血液腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用，血液腫瘤已進(jìn)入了個(gè)體化治療的時(shí)代。目前臨床認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞是來(lái)源于人體的正常細(xì)胞，由多基因突變積累導(dǎo)致其出現(xiàn)異常的特性，因此分子水平的關(guān)鍵變化和特征更能反映疾病的本質(zhì)。分子病理的檢測(cè)結(jié)果可以用于腫瘤的精準(zhǔn)診斷和分類(lèi)，指導(dǎo)治療方案的選擇，為患者的預(yù)后提供寶貴信息。分子病理可以用于初診以及療效和微小殘留病的監(jiān)控。本文主要就分子病理的一些技術(shù)進(jìn)行論述，尤其就二代測(cè)序的臨床應(yīng)用，以MDS 為例進(jìn)行介紹，以助臨床更好地選擇分子病理檢測(cè)項(xiàng)目，了解各種技術(shù)的用途及局限性，使醫(yī)師能更好地解讀和應(yīng)用分子病理檢測(cè)結(jié)果，為臨床診斷和治療決策提供有用信息。

二代測(cè)序技術(shù)的方法概況

相對(duì)于第一代的Sanger 測(cè)序法，二代測(cè)序技術(shù)是近十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新的分子生物學(xué)技術(shù)，其特點(diǎn)是通量高，可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因、多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，可用于檢測(cè)基因突變、基因重排、基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)改變等。

一、二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，其臨床應(yīng)用前景越來(lái)越清晰，在過(guò)去的2 年中，美國(guó)食品和藥品管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了多個(gè)基于二代測(cè)序平臺(tái)的診斷產(chǎn)品。2018 年9 月，Miseq 二代測(cè)序儀獲得了中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械注冊(cè)批準(zhǔn)，意味著我國(guó)的醫(yī)院及其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)可采用其進(jìn)行體外診斷檢測(cè)。與此同時(shí)，多家國(guó)內(nèi)公司研制的基于高通量測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)試劑盒也獲得了國(guó)家藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，或已進(jìn)入審批的后期階段，這些都意味著二代測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用獲得了我國(guó)監(jiān)督部門(mén)的認(rèn)可。

二、目前其他檢測(cè)方法的不足

1.骨髓染色體核型分析：骨髓染色體核型分析是20 世紀(jì)50 年代發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于血液腫瘤的診斷，費(fèi)用低廉，也為臨床醫(yī)師所熟悉，已被列入多個(gè)臨床指南中。目前，MDS 的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估也主要是基于細(xì)胞遺傳學(xué)特征。但染色體核型分析耗時(shí)較長(zhǎng)，有時(shí)會(huì)由于樣本細(xì)胞的分裂能力欠佳，造成實(shí)驗(yàn)失敗。MDS 患者中有接近一半是正常核型，但這類(lèi)患者當(dāng)中仍可能存在核型分析檢測(cè)不出的點(diǎn)突變或移碼突變，尤其是有診斷和預(yù)后意義的基因，如SF3B1、TP53、ASXL1、ETV6、RUNX1 和EZH2 等以及2019 年8 版美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)治療指南中提示的基因[6-7]。

2.熒光原位雜交技術(shù)：作為核型分析的補(bǔ)充，該技術(shù)可以檢測(cè)常見(jiàn)的大片段擴(kuò)增、缺失及基因重排等，但對(duì)于核型正常的病例沒(méi)有幫助。由于MDS 疾病的異質(zhì)性，目前研究者發(fā)現(xiàn)的突變基因數(shù)目很多，已報(bào)道的突變位點(diǎn)也很多，需要一項(xiàng)高通量的分子檢測(cè)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)檢測(cè)目的。

可見(jiàn)，臨床在MDS 的診斷和治療決策中需要越來(lái)越重視二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用。染色體核型分析可與二代測(cè)序檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，并可在治療過(guò)程中使用二代測(cè)序方法對(duì)突變頻率、突變類(lèi)型和治療效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

對(duì)于分子診斷中用到的其他分子生物學(xué)技術(shù)，包括以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的定量定性PCR、數(shù)字PCR、一代測(cè)序、二代測(cè)序技術(shù)及染色體微陣列技術(shù)，本文從檢測(cè)的靈敏度、通量、能夠檢測(cè)到的變異類(lèi)型及定性還是定量等方面進(jìn)行總結(jié)及比較（見(jiàn)表1）。

二代測(cè)序技術(shù)在MDS 診斷、預(yù)后判斷和治療決策中的作用

MDS 是一類(lèi)異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病，主要表現(xiàn)為血液系統(tǒng)中一系或多系血細(xì)胞的減少，并伴有骨髓中原始細(xì)胞形態(tài)學(xué)的異常，分子病理的檢測(cè)結(jié)果不能單獨(dú)作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。分子病理的檢測(cè)可以幫助排除良性原因,例如營(yíng)養(yǎng)不良造成的循環(huán)系統(tǒng)中成熟細(xì)胞減少。理論上來(lái)說(shuō),營(yíng)養(yǎng)不良引起的成熟細(xì)胞減少是不伴隨有基因突變的。分子病理檢測(cè)陽(yáng)性但不滿(mǎn)足其他MDS 診斷標(biāo)準(zhǔn)，提示存在克隆性造血。骨髓中幼稚細(xì)胞百分比達(dá)5%～19%是診斷MDS 的重要標(biāo)準(zhǔn)，而MDS 患者中如檢測(cè)出AML 中的重現(xiàn)性染色體異常，即使骨髓中幼稚細(xì)胞的百分比未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，也診斷為AML[1]。攜帶突變頻率超過(guò)10%的病理性突變,并且體細(xì)胞突變數(shù)目超過(guò)2 個(gè),突變基因包括剪切因子、RUNX1 或JAK2 對(duì)于髓系腫瘤的診斷有預(yù)測(cè)意義[6]。當(dāng)存在一定的形態(tài)學(xué)證據(jù)，卻不完全符合MDS 的臨床診斷學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，上述的陽(yáng)性分子病理檢測(cè)結(jié)果可以提供一定的支持性證據(jù)。2016 年WHO 及NCCN 2018 指南又增加了一些分子生物學(xué)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，有23 個(gè)基因明確列入指南可以輔助診斷，并提供預(yù)后信息（見(jiàn)表2）。需要注意的是，這些突變并不是MDS 特有的，也不是所有的MDS 患者都會(huì)檢測(cè)到表中所列的突變，需要與其他臨床信息結(jié)合起來(lái)進(jìn)行綜合判斷。以下就MDS 中文獻(xiàn)報(bào)道較多的、突變頻率較高的基因進(jìn)行歸納。

一、診斷、分型中的作用

二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出的基因突變信息也可以幫助醫(yī)師對(duì)MDS 患者進(jìn)行更好的診斷和分型。MDS 的診斷是一種排除性診斷，因?yàn)槠渑R床表現(xiàn)與再生障礙性貧血、免疫性血小板減少癥等疾病有一定的重疊和交叉。多篇文獻(xiàn)報(bào)道顯示，這些疾病的突變基因有很大程度的重合，目前尚沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特征性的疾病特異基因。

二、預(yù)后中評(píng)估的作用

1.剪切因子3B1（splicing factor 3B1,SF3B1）：SF3B1 參與編碼RNA 剪接,在MDS 患者中的突變率為20%～30%。SF3B1 基因突變與骨髓環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞（ring sideroblast,RS）增多呈特異性相關(guān)，約80%的MDS-RS 伴有該突變，可用于輔助分型診斷。SF3B1 作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子，SF3B1 基因突變提示患者預(yù)后良好[8]。SF3B1 點(diǎn)突變標(biāo)志著醫(yī)學(xué)界第一次將分子水平的變化與MDS 的一個(gè)形態(tài)學(xué)亞型聯(lián)系起來(lái)。研究表明，SF3B1 突變作為疾病發(fā)展過(guò)程中的早期事件，與疾病預(yù)后相關(guān)聯(lián)；相反作為形態(tài)學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的RS 比例反倒與疾病預(yù)后不相關(guān)[9]。2016 年WHO 分類(lèi)系統(tǒng)中MDS-RS 被列為一個(gè)類(lèi)別[1]。

表1 各種檢測(cè)技術(shù)及特點(diǎn)

2.其他：現(xiàn)有的預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)主要依據(jù)血常規(guī)檢查、骨髓形態(tài)學(xué)分析及細(xì)胞核型分析，二代測(cè)序結(jié)果將對(duì)預(yù)后評(píng)分重新修正。例如TP53、ASXL1、ETV6、RUNX1 和EZH2 基因突變導(dǎo)致預(yù)后不良，以上任何一個(gè)基因的點(diǎn)突變都使MDS 的風(fēng)險(xiǎn)增加一級(jí)。如國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)修訂版定義的低?；颊撸绻霈F(xiàn)以上任何一個(gè)基因突變，其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估即為中級(jí)[10-14]。

二、指導(dǎo)耐藥

對(duì)于低風(fēng)險(xiǎn)和中級(jí)風(fēng)險(xiǎn)的MDS 患者、或高風(fēng)險(xiǎn)但不適合高強(qiáng)度化療的患者，現(xiàn)有的臨床指南推薦低強(qiáng)度的藥物治療，如氮胞苷、地西他濱、抗胸腺細(xì)胞球蛋白、環(huán)孢素或沙利度胺。甲基化相關(guān)基因突變的患者（TET2、DNMT3A、IDH1、IDH2）可能對(duì)去甲基化藥物敏感[15-16]。在接受移植的MDS 患者中，攜帶TP53、TET2、DNMT3A 突變的患者總生存率較低[17-18]。對(duì)于沒(méi)有5q 缺失的患者，采用來(lái)那度胺治療的有效率只有25%，中位反應(yīng)時(shí)間小于1 年。然而對(duì)有5q 缺失的患者，來(lái)那度胺的有效率達(dá)70%，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2 年；有5q 缺失同時(shí)帶有TP53 基因突變的患者，5q 缺失對(duì)藥物療效的預(yù)測(cè)價(jià)值有修正作用[19-22]。換句話說(shuō)，二代測(cè)序技術(shù)分析得到的基因突變信息可以幫助選擇治療方案。

全部患者均順利的完成了治療,研究組的臨床治療有效率是97.8%(45/46),共有30例顯效,15例有效,1例無(wú)效,對(duì)照組的臨床有效率是82.6%(38/46),其中23例顯效,15例有效,8例無(wú)效。研究組的臨床治療有效率比對(duì)照組高,結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P<0.05)。研究組的不良反應(yīng)率是8.7%(4/46),對(duì)照組不良反應(yīng)率是23.9%(11/46),研究組不良反應(yīng)率比對(duì)照組低,結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P<0.05)。

三、測(cè)序基因

1.TET2：TET2 編碼DNA 去甲基化酶，通常認(rèn)為其是一個(gè)抑癌基因，突變常見(jiàn)于血液系統(tǒng)的腫瘤和淋巴瘤（20%～25%），被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生過(guò)程的早期事件，在未知潛能的克隆造血、意義未明的克隆性血細(xì)胞減少、MDS 和AML 中都有報(bào)道。因此，有研究認(rèn)為對(duì)TET2 突變結(jié)果的解讀應(yīng)與其突變頻率結(jié)合起來(lái)，高頻率的TET2 突變對(duì)疾病的發(fā)生更有提示價(jià)值，并且應(yīng)對(duì)與TET2 同時(shí)發(fā)生的其他基因和通路的突變予以關(guān)注并綜合解讀。TET2 基因突變與治療效果間的相關(guān)性已有研究報(bào)道[7]，包括去甲基化藥物治療和骨髓移植的治療方案，而筆者認(rèn)為現(xiàn)有的證據(jù)級(jí)別尚不夠強(qiáng)，不足以根據(jù)基因突變選擇治療方案。TET2 基因突變頻率與治療效果的定量關(guān)系并不好，因此不適宜作為微小殘留病的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

2..ASXL1：ASXL1 編碼表觀遺傳學(xué)通路中的一個(gè)染色體結(jié)合蛋白，在多種血液腫瘤和實(shí)體腫瘤中均有突變（15%～25%）。ASXL1 通常被認(rèn)為是一個(gè)抑癌基因，突變形式主要是移碼和無(wú)義突變?cè)斐傻墓δ苋笔?。ASXL1 基因突變結(jié)果不能單獨(dú)使用作為疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。在預(yù)后方面，ASXL1 被認(rèn)為是一個(gè)預(yù)后不良的獨(dú)立因素，ASXL1 基因突變使MDS 的風(fēng)險(xiǎn)在原有基礎(chǔ)上增加一級(jí)[7]。

3.EZH2：EZH2 編碼一個(gè)表觀遺傳學(xué)通路中組蛋白的甲基化轉(zhuǎn)移酶，在多種血液腫瘤和實(shí)體腫瘤中均有突變（突變率為5%～10%）。EZH2 突變形式為無(wú)義或移碼造成的功能缺失，但在酶活性區(qū)域的重現(xiàn)性錯(cuò)義突變也值得關(guān)注，如Y646 位置的錯(cuò)義突變。EZH2 也被認(rèn)為與預(yù)后不良相關(guān)，EZH2 基因突變使MDS 的風(fēng)險(xiǎn)在原有基礎(chǔ)上增加一級(jí)[6-7]。全球多個(gè)制藥公司均有以EZH2 為靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)項(xiàng)目，例如美國(guó)的tazemetostat 目前已處于臨床試驗(yàn)階段,并已向美國(guó)食品和藥品管理局遞交了上市申請(qǐng)。EZH2 抑制劑與現(xiàn)有的治療方案或免疫治療方案聯(lián)合的臨床試驗(yàn)均值得關(guān)注。

4.SF3B1：SF3B1 編碼剪切復(fù)合體的一個(gè)成分，該復(fù)合體識(shí)別剪切位點(diǎn)，去除mRNA 前體中的內(nèi)含子，與SRSF2、U2AF1 和ZRSR2 都在RNA 剪切復(fù)合體中發(fā)揮作用。SF3B1也在姐妹染色體的融合和分離過(guò)程中發(fā)揮作用。SF3B1 突變常見(jiàn)于MDS 患者中，其突變率為20%～30%。突變形式多為錯(cuò)義突變，而不是無(wú)義或移碼造成的功能缺失。SF3B1 基因突變與骨髓RS 增多特異性相關(guān)，約80%的MDS-RS 患者伴有該突變，可用于分型輔助診斷。SF3B1 作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子，SF3B1 基因突變提示患者預(yù)后良好[8]。2016 年的WHO 分類(lèi)系統(tǒng)中，MDS-RS 被列為一個(gè)類(lèi)別[1]。

5.SRSF2：其編碼剪切復(fù)合體的一個(gè)成分，與SF3B1、U2AF1、ZRSR2 處于一個(gè)通路中。目前數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的該基因突變主要為錯(cuò)義突變P95，但此目錄在不斷更新[17]。

6.RUNX1：RUNX1 編碼造血細(xì)胞分化過(guò)程中的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，其突變常見(jiàn)于血液系統(tǒng)腫瘤，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生過(guò)程中的重要驅(qū)動(dòng)基因。其突變形式主要是移碼和無(wú)義突變?cè)斐傻墓δ苋笔?，以及基因融合?；颊咧腥鐧z測(cè)出急性髓系白血病中的重現(xiàn)性染色體異常，如t(8,21)RUNX1融合基因，即使骨髓中幼稚細(xì)胞的百分比未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，也診斷為急性髓系白血病[1]。因?yàn)镽UNX1 基因功能的重要性，其突變是影響患者預(yù)后的重要基因，該基因突變與MDS 預(yù)后不良相關(guān)[7]。

7.TP53：TP53 編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，后者整合來(lái)自上游的多種信號(hào)，在DNA 損傷和修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TP53是最常見(jiàn)的腫瘤突變基因，其功能與其組織及細(xì)胞來(lái)源都有關(guān)系，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的守護(hù)基因。TP53常見(jiàn)的突變形式為功能缺失，但在MDS 當(dāng)中的突變以錯(cuò)義突變?yōu)橹?包括R248、R249、R273 和R282。TP53 基因突變與MDS 預(yù)后不良相關(guān)。TP53 基因突變狀態(tài)對(duì)于MDS 的預(yù)后修正效果比較顯著，在多篇文獻(xiàn)中均有報(bào)道。TP53 基于突變與復(fù)雜核型相關(guān)，在復(fù)雜核型的患者中，約有55%的復(fù)雜核型患者攜帶TP53 基因突變。TP53 基因突變?cè)诶^發(fā)和復(fù)發(fā)難治的病例中更為常見(jiàn)[18-22]。

總的來(lái)說(shuō),MDS 患者中發(fā)現(xiàn)的突變基因，除了SF3B1，多與不良預(yù)后相關(guān)，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因如TP53 和RUNX1對(duì)于預(yù)后的影響大于編碼表觀遺傳學(xué)通路和RNA 剪切通路的基因（見(jiàn)圖1）。通常情況下，突變基因數(shù)目越多，預(yù)后越差。二代測(cè)序結(jié)果的解讀需要綜合基因變異類(lèi)型和豐度、異常細(xì)胞的數(shù)目及免疫表型、克隆演化及治療干預(yù)等信息。

現(xiàn)階段二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于臨床的方法學(xué)及規(guī)范

一、明確檢測(cè)目的

在設(shè)計(jì)或選擇二代測(cè)序的檢測(cè)時(shí)，首先要明確的是檢測(cè)的目的、需要診斷的疾病類(lèi)型、檢測(cè)使用的樣本、需要檢測(cè)的突變類(lèi)型等。檢測(cè)的目的決定了檢測(cè)需要覆蓋的基因的選擇、測(cè)序的深度及生物信息分析的流程。如果檢測(cè)的主要目的是臨床實(shí)踐，臨床指南中明確的基因數(shù)目通常不是非常大，一個(gè)精心選擇的小基因panel（＜50 個(gè)基因）即可滿(mǎn)足需要。相反，如果檢測(cè)的主要目的是為臨床試驗(yàn)選擇合適的患者，并帶有科學(xué)研究的目的，包含上百個(gè)基因的panel 可能更為合適。血液腫瘤也需要評(píng)估腫瘤細(xì)胞含量，通過(guò)外周血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)可以評(píng)估，這對(duì)于檢測(cè)的靈敏度和解讀突變頻率有幫助。檢測(cè)遺傳性基因與腫瘤的體細(xì)胞突變所需要的測(cè)序深度是不同的，不同的突變類(lèi)型、不同大小的缺失插入、拷貝數(shù)變異、基因融合所需要的生物信息學(xué)流程及參數(shù)也不同。從臨床應(yīng)用的角度來(lái)看，將5%的突變頻率設(shè)為檢測(cè)下限是合理的，但在檢測(cè)微小殘留病時(shí)，?。?%的檢測(cè)靈敏度是非常有益的。對(duì)于遺傳性的純合或雜合變異，最低30×的測(cè)序深度即可滿(mǎn)足要求；對(duì)于腫瘤中的體細(xì)胞變異，要求1 000×的測(cè)序深度[24]。

二、方法學(xué)及檢測(cè)質(zhì)量控制

1.步驟環(huán)節(jié)：二代測(cè)序的步驟主要包括樣本制備、文庫(kù)制備、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析4 個(gè)部分，而樣本制備的步驟中，樣本的類(lèi)型、采集、儲(chǔ)存都決定了提取的方法及質(zhì)量。血液腫瘤常用的檢測(cè)標(biāo)本為骨髓或外周血，因此患者在接受過(guò)骨髓移植或輸血后不應(yīng)立即采樣進(jìn)行分子檢測(cè)。對(duì)于MDS 這類(lèi)全血細(xì)胞減少的疾病，強(qiáng)烈推薦用骨髓作為檢測(cè)樣本。建議疑診為MDS 的患者，在初診時(shí)應(yīng)采集骨髓進(jìn)行二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)，樣本采集量為1～3 mL，使用EDTA 抗凝管。在骨髓樣本難以獲得或質(zhì)量不滿(mǎn)足要求時(shí)，外周血樣本也可以接受。樣本應(yīng)冷藏保存，在72 h 內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。文庫(kù)制備以雜交捕獲和多重?cái)U(kuò)增2 種方式為基礎(chǔ)。二代測(cè)序的主流平臺(tái)為Illumina（以合成為基礎(chǔ)的技術(shù)平臺(tái)）和Thermo Fisher（基于半導(dǎo)體技術(shù)的平臺(tái)）。

2.方法學(xué)驗(yàn)證和質(zhì)量保證：二代測(cè)序技術(shù)的高通量特點(diǎn)為其方法學(xué)驗(yàn)證提出了很大的挑戰(zhàn)。二代測(cè)序的方法學(xué)驗(yàn)證需要覆蓋打算檢測(cè)的標(biāo)本類(lèi)型，驗(yàn)證突變類(lèi)型、檢測(cè)靈敏度下限，按照臨床分子病理實(shí)驗(yàn)室的要求進(jìn)行方法學(xué)的驗(yàn)證，并對(duì)驗(yàn)證方案和結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)和規(guī)范的記錄[25]。例如，一個(gè)用于檢測(cè)骨髓樣本的二代測(cè)序panel，如果打算用于檢測(cè)血漿中的游離DNA，則需要對(duì)此樣本類(lèi)型進(jìn)行驗(yàn)證，因?yàn)檫@2 種樣本中的DNA 豐度和質(zhì)量有著非常大的差異。TP53基因突變和缺失都是MDS 患者中常見(jiàn)的異常，一個(gè)二代測(cè)序檢測(cè)對(duì)這2 種突變類(lèi)型的檢出效率和靈敏度可能并不相同，需要分別進(jìn)行驗(yàn)證。

二代測(cè)序上機(jī)的原始數(shù)據(jù)通過(guò)生物信息分析識(shí)別變異，如果生物信息分析流程的建立、驗(yàn)證及監(jiān)控出現(xiàn)問(wèn)題，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，進(jìn)而影響患者的臨床診斷和治療決策。二代測(cè)序的生物信息學(xué)分析主要包括序列比對(duì)、變異識(shí)別、變異過(guò)濾、變異注釋?zhuān)约鞍凑张R床意義對(duì)變異進(jìn)行優(yōu)先度排序并逐級(jí)報(bào)告。目前，用于二代測(cè)序生物信息分析流程的軟件有商業(yè)化的、封閉的軟件或組合廣泛認(rèn)可的、開(kāi)源的分析模塊。理想的臨床實(shí)驗(yàn)室生物信息分析流程是自動(dòng)化的，可提供合適的質(zhì)量控制參數(shù)保證結(jié)果，是可靠的、準(zhǔn)確的、可重復(fù)的及可追溯的[25]。

三、測(cè)序結(jié)果的報(bào)告規(guī)范及解讀

1.結(jié)果報(bào)告：2017 年美國(guó)分子病理學(xué)會(huì)、美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)、美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)及美國(guó)病理學(xué)會(huì)聯(lián)合發(fā)表的指南，推薦四類(lèi)檢測(cè)結(jié)果分類(lèi)系統(tǒng)。第一類(lèi)為強(qiáng)臨床意義的變異；第二類(lèi)為潛在臨床意義的變異；第三類(lèi)為臨床意義不明的變異；第四類(lèi)為良性或可能良性的變異[25-28]。

（1）第一類(lèi)：歸入第一類(lèi)的變異通常有A 類(lèi)和B 類(lèi)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，A 類(lèi)證據(jù)包括美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)或醫(yī)學(xué)指南中推薦對(duì)某一特定腫瘤類(lèi)型的療效和耐藥有預(yù)測(cè)作用的生物標(biāo)志物；醫(yī)學(xué)指南中推薦的對(duì)特定腫瘤類(lèi)型有診斷和預(yù)后價(jià)值的生物標(biāo)志物。

（2）第二類(lèi)：B 類(lèi)證據(jù)包括高質(zhì)量的臨床試驗(yàn)研究中報(bào)道的對(duì)某一特定腫瘤類(lèi)型的療效和耐藥有預(yù)測(cè)作用的生物標(biāo)志物，并獲得專(zhuān)家共識(shí)；高質(zhì)量的臨床試驗(yàn)研究中報(bào)道的對(duì)某一特定腫瘤類(lèi)型有診斷和預(yù)后價(jià)值的生物標(biāo)志物，并獲得專(zhuān)家共識(shí)。歸入第二類(lèi)的變異通常有C 類(lèi)和D 類(lèi)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，C 類(lèi)證據(jù)包括美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)或醫(yī)學(xué)指南中針對(duì)其他腫瘤類(lèi)型的療效和耐藥有預(yù)測(cè)作用的生物標(biāo)志物；用于臨床試驗(yàn)入排標(biāo)準(zhǔn)的生物標(biāo)志物；多個(gè)小規(guī)模的臨床試驗(yàn)中報(bào)道的對(duì)某一特定腫瘤類(lèi)型有診斷和預(yù)后價(jià)值的生物標(biāo)志物。D 類(lèi)證據(jù)包括經(jīng)研究推斷對(duì)治療有指導(dǎo)價(jià)值的生物標(biāo)志物；小規(guī)模研究或幾例病例報(bào)道的單獨(dú)或與其他結(jié)果結(jié)合起來(lái)對(duì)診斷和預(yù)后有價(jià)值的生物標(biāo)志物。由此可見(jiàn)，文獻(xiàn)、醫(yī)學(xué)指南及大規(guī)模的腫瘤突變數(shù)據(jù)庫(kù)仍是變異解讀和分類(lèi)的主要依據(jù)。這里就一個(gè)病例來(lái)說(shuō)明變異的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。63 歲的男性患者，其二代測(cè)序在TP53 的外顯子區(qū)域檢測(cè)出以下3 個(gè)變異，NM_000546：c.C215G（p.P72R），頻率為47.3%；NM_000546：c.572_574del（p.191_192del），頻率41.5%；NM_000546：c.C844T（p.R282W），頻率45.2%。第一個(gè)變異在千人基因組（正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)）中有收錄，是正常人群中常見(jiàn)的多態(tài)性，是良性變異，被歸為第四類(lèi)。第二個(gè)變異在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有收錄,說(shuō)明這個(gè)變異在正常人中罕見(jiàn)；在腫瘤體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫(kù)中有收錄,3 例為神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，1 例為生殖系統(tǒng)腫瘤，1 例為造血淋巴系統(tǒng)腫瘤，1 例為腎臟腫瘤，1 例為肝臟腫瘤，1 例為卵巢腫瘤，1 例為軟組織腫瘤。此變異位于TP53 的DNA 結(jié)合區(qū)域，但不是與DNA 結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。文獻(xiàn)報(bào)道中沒(méi)有見(jiàn)到此變異與預(yù)后或診斷的關(guān)系。綜合已有的證據(jù)，將其歸為第三類(lèi)，為臨床意義不明的變異。第三個(gè)變異在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有收錄，在腫瘤體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄303 次。文獻(xiàn)中有證據(jù)顯示，腫瘤組織中此變異與TP53 的異常表達(dá)相關(guān)，與患者較短的生存時(shí)間相關(guān)，但該研究規(guī)模不大[22]。綜合起來(lái)，將此變異歸為第二類(lèi)。

腫瘤基因組學(xué)發(fā)展迅速，變異的分類(lèi)也需要不斷更新。報(bào)告需要使用專(zhuān)業(yè)的命名和術(shù)語(yǔ)，要清晰地描述檢測(cè)方法和局限性；建議要簡(jiǎn)潔，并與組織病理及臨床發(fā)現(xiàn)相結(jié)合。臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的二代測(cè)序結(jié)果報(bào)告是為臨床服務(wù)的，報(bào)告內(nèi)容圍繞預(yù)防、診斷、預(yù)后和治療的臨床相關(guān)性和意義[26-28]。

小結(jié)及展望

與其他分子檢測(cè)技術(shù)相比，二代測(cè)序技術(shù)的高通量?jī)?yōu)勢(shì)非常明顯，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的多個(gè)位點(diǎn)及多種突變形式，降低了對(duì)樣本量的要求。精心設(shè)計(jì)及驗(yàn)證的靶向測(cè)序項(xiàng)目簡(jiǎn)化了醫(yī)師對(duì)基因和項(xiàng)目的選擇，靶向測(cè)序基因選擇的靈活性可以滿(mǎn)足不同臨床需求，臨床應(yīng)用的空間很大。除了滿(mǎn)足臨床需求，二代測(cè)序產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)有很高的科研價(jià)值，可以增加人們對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制的了解，發(fā)現(xiàn)新的診斷預(yù)后和治療的生物標(biāo)志物，推動(dòng)新的治療的研究和應(yīng)用。盡管?chē)?guó)外已經(jīng)進(jìn)行過(guò)大樣本的研究，我國(guó)的人群研究仍然可以發(fā)現(xiàn)新的特征。對(duì)我國(guó)人群和樣本的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行解讀，尤其是對(duì)臨床意義還不明確的變異結(jié)果進(jìn)行解讀，需要我國(guó)人群的研究數(shù)據(jù)來(lái)解釋。我國(guó)人群的遺傳背景、生活方式及暴露的環(huán)境因素與西方人不同，使用目前常用的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)我國(guó)人群基因變異的注釋和解讀的準(zhǔn)確性及可靠性會(huì)低于西方人群。將基因檢測(cè)數(shù)據(jù)與結(jié)構(gòu)化的病歷資料整合起來(lái)，并對(duì)此大數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，會(huì)產(chǎn)生非常有價(jià)值的信息。這里想強(qiáng)調(diào)的是這樣的大數(shù)據(jù)分析應(yīng)該建立在高質(zhì)量的、系統(tǒng)化的“knowledge base”而不是一個(gè)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)的“data bank”。隨著免疫治療藥物PD-1/PD-L1 藥物在全球上市，腫瘤免疫治療逐漸占居了腫瘤治療的中心位置。MDS 患者中的高基因突變率提示其可能表達(dá)多種腫瘤抗原，在此類(lèi)患者或部分患者中使用免疫治療可能會(huì)有效果。預(yù)測(cè)免疫治療效果的生物標(biāo)志物也是目前的研究熱點(diǎn)。二代測(cè)序產(chǎn)生的腫瘤突變負(fù)荷的數(shù)據(jù)可以為臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

SF3B1 第一次在分子水平上定義了一個(gè)MDS 亞型，人們也期待這樣的分子標(biāo)志物會(huì)越來(lái)越多，分子水平定義的MDS 亞型能夠取代現(xiàn)在的關(guān)于腫瘤異質(zhì)性的描述?，F(xiàn)階段腫瘤候選藥物是國(guó)內(nèi)外制藥公司研發(fā)管線中最豐富的產(chǎn)品，這是多年基礎(chǔ)研究積累的結(jié)果，分子水平上發(fā)現(xiàn)的基因突變?yōu)橹扑幪峁┝素S富的藥物靶點(diǎn)，同時(shí)部分獲批的靶向藥物也需要在分子檢測(cè)的指導(dǎo)下使用。這包括近2 年國(guó)外獲批的治療AML 的FLT3 抑制劑midostaurin,IDH1 抑制劑ivosidenib，IDH2 抑制劑enasidenib，相應(yīng)突變?nèi)鏔LT3、IDH1和IDH2 的檢測(cè)方法也隨之建立。測(cè)序數(shù)據(jù)的積累也讓人們意識(shí)到，大部分的基因突變并不是疾病特異的，這為分子標(biāo)志物指導(dǎo)下的“異病同治”提供了生物學(xué)基礎(chǔ)，為藥物的臨床開(kāi)發(fā)策略和臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了新的思路。籃子試驗(yàn)（basket trial）入組的患者包括不同的病理類(lèi)型，但具有相同分子水平的改變，其是美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)分子標(biāo)志物指導(dǎo)的跨瘤種應(yīng)用腫瘤藥物的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。相信二代測(cè)序技術(shù)作為指導(dǎo)MDS 精準(zhǔn)診療的強(qiáng)有力的武器，會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。