姜 江 ，曾志坤，石博文，潘召城，顏 凌，王宇杰，張 歡

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院放射科，上海 200025；2.上海交通大學(xué)物理與天文學(xué)院，上海 200240）

細(xì)胞集體運(yùn)動(dòng)（collective motion）貫穿胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)以及腫瘤轉(zhuǎn)移始終。1863 年，Virchow提出腫瘤細(xì)胞具有阿米巴樣運(yùn)動(dòng)性質(zhì)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)改變自身的形狀驅(qū)動(dòng)自身運(yùn)動(dòng)完成與血管粘附及侵襲過(guò)程[1-5]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移并非完全是單個(gè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，而是通過(guò)集體遷移實(shí)現(xiàn)的[2,6]。在融合生長(zhǎng)的細(xì)胞中，單個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)受到臨近細(xì)胞影響，表現(xiàn)出籠效應(yīng)（caging effect），但這些細(xì)胞運(yùn)動(dòng)對(duì)集體遷移狀態(tài)的影響仍有待研究[7]。

在玻璃體系中，它們的黏滯性如此之大，以至于其在足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出固態(tài)性質(zhì)[8]。Weitz 在研究膠體的運(yùn)動(dòng)性質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，隨著體系中粒子濃度增大，體系的結(jié)構(gòu)弛豫逐漸減慢，這個(gè)結(jié)構(gòu)弛豫隨著密度的增加而減慢直至停止的現(xiàn)象稱為玻璃化轉(zhuǎn)變（glass transition）。

2011 年，研究者在聚丙烯凝聚酰胺膠上培養(yǎng)細(xì)胞，在長(zhǎng)度、時(shí)間以及密度參數(shù)上研究了融合單層上皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，得出在足夠大的長(zhǎng)度尺度和時(shí)間尺度上，隨著細(xì)胞密度的增加，細(xì)胞遷移速度減慢，表現(xiàn)出類似于固體的性質(zhì)，該現(xiàn)象類似于過(guò)冷液體的運(yùn)動(dòng)特征，其將此效應(yīng)類比為玻璃化轉(zhuǎn)變[9]。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的生物學(xué)過(guò)程，腫瘤細(xì)胞完成上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，其自身獲得更強(qiáng)的遷移能力，侵入血管隨著血流遷移到其他臟器[10]。在靜脈系統(tǒng)的微循環(huán)中，腫瘤細(xì)胞遷出血管，分布于細(xì)胞外液中，受到周圍細(xì)胞的影響，其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)發(fā)生改變，但在該環(huán)境中細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)如何改變，是否發(fā)生了玻璃化轉(zhuǎn)變，目前尚無(wú)研究證實(shí)。因此，本研究通過(guò)在液體培養(yǎng)環(huán)境下觀察細(xì)胞在液體中的運(yùn)動(dòng)，以期利用玻璃動(dòng)力學(xué)研究方法，探索腫瘤細(xì)胞在定植過(guò)程中其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的特性。

材料與方法

一、材料

人胃癌細(xì)胞AGS 為上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院血液研究所饋贈(zèng)，psPAX2、pMD2.G 和帶有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pCDH-MSCV-MCS-EF1α-Greenpuro（Cat.#CD713B-1）、293T 細(xì)胞為復(fù)旦大學(xué)生化系呂雷老師實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將293T 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、1%抗生素的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，適時(shí)更換培養(yǎng)液并進(jìn)行細(xì)胞傳代。AGS 細(xì)胞于IMDM/F12（10% FBS）中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：293T 細(xì)胞密度達(dá)到75%時(shí)進(jìn)行慢病毒包裝，包裝質(zhì)粒比例，PsPAX∶pMD2G∶pCDHMSCV-MCS-EF1α-Green puro 為3∶1∶4，具體操作依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書（李記生物有限公司）。轉(zhuǎn)染時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的AGS 細(xì)胞，接種于60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)，加入2 mL 慢病毒液、2 mL 完全培養(yǎng)基以及4 μL 聚凝胺（上海翊圣生物科技有限公司），感染24 h 后更換新鮮培養(yǎng)基加嘌呤霉素（2 μg/mL）篩選2 周。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率：在熒光倒置顯微鏡下，分別于明場(chǎng)和488 nm 處觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

4.共聚焦顯微鏡拍攝：細(xì)胞常規(guī)消化、處理后重懸，靜置20 min 后行實(shí)時(shí)三維立體拍攝，拍攝條件為200 倍放大，并將實(shí)時(shí)圖像放大1.5 倍，激光強(qiáng)度8%，波長(zhǎng)488 nm。圖像中，視場(chǎng)的尺寸為387.5 μm×387.5 μm×50.0 μm，圖像采集時(shí)間間隔為57 s，共計(jì)連續(xù)拍攝90 min。在后續(xù)分析中，細(xì)胞密度的面積分?jǐn)?shù)分別為52.70%、59.57%、63.36%、67.46%。

5.數(shù)據(jù)處理：LAS X Small 3.7.0 20979 軟件將三維圖像信息轉(zhuǎn)化為tiff 文件格式，采用Matlab R2019b 軟件導(dǎo)入tiff 文件得到三維像素灰度圖像，經(jīng)高斯消噪與濾波消噪處理后，統(tǒng)計(jì)背景培養(yǎng)液與細(xì)胞在灰度值上的分布，選取合適的閾值將圖像二值化，得到黑白圖。最后使用分水嶺分割的方法，得到細(xì)胞的位置信息與大小信息，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行追蹤，并得到該體系中每一個(gè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)信息。

結(jié) 果

一、細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

熒光倒置顯微鏡下，觀察到細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率接近于100%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（見圖1）。

圖1 熒光倒置顯微鏡下觀察（×100）

二、液體培養(yǎng)條件下胃癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)分析

1.速度分布：本實(shí)驗(yàn)中，在液體培養(yǎng)條件下，AGS 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度分布隨著統(tǒng)計(jì)間隔時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸變?yōu)楦咚狗植迹浼?xì)胞速度分布函數(shù)與時(shí)間變量相關(guān)。

2.均方位 移（mean square displacements，MSD）：MSD 是衡量細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的常規(guī)參數(shù)，其與時(shí)間間隔Δt 相關(guān)，公式為MSD（Δt）=＜ri(t+Δt)-r(t)＞2，其中ri＜t＞代表細(xì)胞i 在t 時(shí)刻所在的位置，＜…＞表示在時(shí)間上和空間上的平均；而擴(kuò)散系數(shù)D=limΔt→∞MSD（Δt）/Δt。本實(shí)驗(yàn)分別計(jì)算細(xì)胞在X、Y、Z 這3個(gè)方向上運(yùn)動(dòng)的MSD，得到其自擴(kuò)散系數(shù)D。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)在X 與Y 方向上類似，且自擴(kuò)散系數(shù)D 隨密度增加而減小。在Z 方向上，由于存在沉降運(yùn)動(dòng)，相應(yīng)趨勢(shì)不明顯。在X 方向上，長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)散系數(shù)略小于1，總體上胃癌細(xì)胞在X、Y 方向運(yùn)動(dòng)，類似于布朗運(yùn)動(dòng)[11]（見圖2A）。

3.自相關(guān)重疊序參量Q 與四點(diǎn)相關(guān)函數(shù)χ4：密集細(xì)胞表現(xiàn)出玻璃慢動(dòng)力學(xué)，為了進(jìn)一步量化系統(tǒng)中細(xì)胞玻璃動(dòng)力學(xué)的協(xié)同效應(yīng)，引入自相關(guān)重疊序參量Q 進(jìn)行計(jì)算，公式為Q（Δt）=，其中N 代表細(xì)胞的總數(shù)。當(dāng)｜ri（t+Δt）-ri（t）｜＜0.15 d 時(shí)，取ω=1，反之，ω=0。為了量化細(xì)胞間協(xié)同作用的大小和弛豫時(shí)間，本研究另外計(jì)算了表征動(dòng)力學(xué)非均勻性的四點(diǎn)相關(guān)函數(shù)χ4，公式為χ4=N＜Q（Δt）2＞-＜Q（Δt）＞2）。其中，N 代表細(xì)胞的數(shù)量，其峰值與系統(tǒng)的弛豫時(shí)間及細(xì)胞間的協(xié)同作用相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，在X 方向上的計(jì)算顯示，其峰值時(shí)間及高度隨細(xì)胞的密度增加而增加。經(jīng)自相關(guān)重疊序參量Q 得出，t=100 min，系統(tǒng)弛豫時(shí)間與χ4峰值趨近，可推斷出在系統(tǒng)弛豫時(shí)間內(nèi)，體系的動(dòng)力學(xué)非均勻性達(dá)到最大（見圖2B、2C）。χ4峰值所在的位置與系統(tǒng)密度呈正相關(guān)，系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞的密度增大，峰值所在的時(shí)間t 后移，可推出細(xì)胞密度與其在X、Y 軸上的速度呈負(fù)相關(guān)（見圖2D）。

討 論

一、胃癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的前期基礎(chǔ)研究

圖2 胃癌細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)分析

胃癌是全球第四大常見的惡性腫瘤，是導(dǎo)致腫瘤死亡的第二大原因，其發(fā)病隱匿，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移[12]。近年來(lái)，隨著內(nèi)鏡技術(shù)和影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究使得胃癌的早期發(fā)現(xiàn)成為可能，發(fā)病機(jī)制亦得以逐步揭示，臨床治療可選擇面日漸廣泛。但據(jù)統(tǒng)計(jì)目前胃癌的死亡率仍居高不下，60%～80%的胃癌患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，究其原因目前的檢查手段以及治療評(píng)估難以及時(shí)準(zhǔn)確地為臨床治療提供療效信息，這也預(yù)示著單純的生物學(xué)角度的研究難以完全戰(zhàn)勝腫瘤[13]。隨著應(yīng)用物理學(xué)家與生物學(xué)家合作的不斷展開，腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程得以被多角度詮釋。生物學(xué)家提出在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中細(xì)胞完成上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而獲得更強(qiáng)的粘附以及遷移能力，其運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)類似于流體性質(zhì)，隨著血管轉(zhuǎn)移或者淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞通過(guò)完成間質(zhì)上皮化轉(zhuǎn)變過(guò)程，遷移能力減弱，其類似于固體運(yùn)動(dòng)性質(zhì)，從而有助于細(xì)胞外液中的腫瘤細(xì)胞成功定植于靶器官中[14]。

二、本研究的實(shí)踐意義

腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞外液中的運(yùn)動(dòng)特性對(duì)細(xì)胞完成定植至關(guān)重要。目前的研究多集中于在固體培養(yǎng)基中探究細(xì)胞的玻璃化運(yùn)動(dòng)特征，對(duì)于液體環(huán)境中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性探索尚無(wú)研究證實(shí)。本研究將玻璃動(dòng)力學(xué)分析方法應(yīng)用于分析液體培養(yǎng)條件下胃癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，以模擬腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞外液中的運(yùn)動(dòng)規(guī)律。對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度的分析得出，在液體環(huán)境中，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)類似于流體性質(zhì)，即隨著體系中細(xì)胞密度的增加，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度、自擴(kuò)散系數(shù)D 隨著密度增加而減小，從而表現(xiàn)出玻璃化轉(zhuǎn)變性質(zhì)，該特點(diǎn)有利于細(xì)胞完成定植并最終實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。

目前臨床評(píng)估療效的手段多依賴于影像學(xué)以及生物學(xué)技術(shù)，難以為臨床提供及時(shí)、準(zhǔn)確的療效信息。本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用玻璃動(dòng)力學(xué)分析方法可在短時(shí)間內(nèi)研究細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，而在后續(xù)的工作中，本研究將該方法運(yùn)用到添加化療藥物后的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)分析中，以期為臨床研究提供及時(shí)有效的療效信息。