王錫蘭，田 軍

(余姚市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 余姚 315400)

肝炎指的是體內(nèi)肝臟組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，其中最常見(jiàn)的病因?yàn)椴《靖腥尽Ｓ醒芯恐赋?，巨?xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)具有阻滯機(jī)體免疫功能，減輕殺傷性免疫細(xì)胞殺傷力的作用[1]。因兒童發(fā)育尚未成熟，在肝臟受CMV感染時(shí)，可嚴(yán)重影響機(jī)體肝臟功能與免疫功能，嚴(yán)重?fù)p害肝臟組織，且可通過(guò)血液途徑流向全身，嚴(yán)重時(shí)可引起患兒死亡。T淋巴細(xì)胞是一種常見(jiàn)的免疫細(xì)胞，其免疫活性較強(qiáng)，在機(jī)體受感染時(shí)，可快速做出相關(guān)的免疫應(yīng)答，進(jìn)而可維持體內(nèi)平衡狀態(tài)。本研究通過(guò)檢測(cè)65例CMV感染致肝炎患兒外周血CD3、CD4、CD8及CD4/CD8 T淋巴細(xì)胞亞群的水平，進(jìn)而分析其與CMV載量的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年3月至2018年3月在余姚市第二人民醫(yī)院就診的65例CMV感染致肝炎患兒為病例組，男37例，女28例；年齡為5～15歲，平均為(12.14±2.43)歲。另選取同期30例體檢健康兒童(均無(wú)CMV感染)為對(duì)照組，男18例，女12例；年齡為6～14歲，平均為(12.25±2.54)歲。兩組性別和年齡的比較均無(wú)明顯差異(均P>0.05)。根據(jù)病例組患兒CMV載量水平的不同，將其分為低載量組(CMV<1×104拷貝/mL)、中載量組(CMV為1×104～ <5×104拷貝/mL)、高載量組(CMV為5×104～10×104拷貝/mL)。本研究?jī)?nèi)容已通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡為5～15歲；病例組患兒存在干咳、高熱等病毒性肝炎的明顯臨床癥狀；無(wú)免疫功能缺陷或功能不全；伴有嚴(yán)重心、腦、肺、肝、腎等器質(zhì)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：酒精或藥物等引起肝功能損傷；非病毒性肝炎；伴有抗病毒藥物治療史；近期使用免疫類藥物；依從性較差，或中途終止參與本研究者。

1.3方法

1.3.1血液的采集

抽取清晨空腹靜脈血8mL，將其放置在無(wú)病毒無(wú)菌抗凝試管中，經(jīng)3 500r/min，5min離心處理后分離血清，將各個(gè)血液標(biāo)本分為等量的兩組，一組用于T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)，另一組用于CMV載量的檢測(cè)，全部標(biāo)本均于2h內(nèi)檢測(cè)。

1.3.2外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)

采用熒光定量PCR儀(瑞士羅氏診斷公司，型號(hào)為z480)與T淋巴細(xì)胞亞群熒光試劑(試劑盒購(gòu)自中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司)對(duì)血液標(biāo)本行免疫熒光抗體標(biāo)記，分離T淋巴細(xì)胞后進(jìn)行涂片，經(jīng)自然干燥，固定后加樣，CD3、CD4及CD8熒光標(biāo)記抗體使用濃度為1∶5，孵育溫度為37℃、1h。之后加入抗凝血試劑進(jìn)行充分混勻，經(jīng)10min后采用自動(dòng)溶血儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，型號(hào)為Q-PRER)進(jìn)行溶血，在流式細(xì)胞儀(美國(guó) Becton Dicknson公司，型號(hào)為FACSCalibur)進(jìn)行參數(shù)調(diào)整，行T淋巴細(xì)胞亞群水平的檢測(cè)。對(duì)10 000個(gè)T淋巴細(xì)胞表面分子CD3、CD4及CD8的百分率進(jìn)行計(jì)算，嚴(yán)格按照說(shuō)明書指示進(jìn)行檢測(cè)操作。

1.3.3 CMV載量的檢測(cè)

通過(guò)K3EDTA抗凝試劑對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行抗凝處理，采用熒光定量PCR儀及其配套試劑盒對(duì)CMV進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，常規(guī)提取血漿中CMV DNA，在擴(kuò)增儀上行DNA擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)CMV載量水平進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書指示進(jìn)行檢測(cè)操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1病例組與對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平的比較

病例組患兒外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著降低(均P<0.01)；而CD8水平比較并無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2不同CMV載量組外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平的比較

根據(jù)病例組患兒CMV載量水平的不同，分為低載量組21例、中載量組29例、高載量組15例。低載量組外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表達(dá)水平較中載量組均顯著升高(q值分別為10.12、4.63、6.85，均P<0.05)，較高載量組亦均顯著升高(q值分別為15.96、7.68、7.95，均P<0.05)，中載量組外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表達(dá)水平較高載量組均顯著升高(q值分別為11.05、7.36、7.84，均P<0.05)；而三組CD8水平比較并無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

組別例數(shù)(n)CD3CD4CD8CD4/CD8低載量組2163.62±4.8236.99±4.1229.98±2.061.22±0.23中載量組2956.98±5.2233.96±3.1030.87±2.251.03±0.19高載量組1544.08±5.7329.78±2.7530.98±2.260.91±0.18F23.9519.531.8428.86P<0.01<0.010.17<0.01

2.3病例組CMV載量與外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平的Pearson相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CMV載量與CD3、CD4及CD4/CD8均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(r值分別為-0.58、-0.53、-0.73，均P<0.01)，而與CD8的水平并無(wú)明顯關(guān)系(r=0.10，P>0.05)。

3討論

3.1 CMV的危害性

CMV是病毒性肝炎常見(jiàn)性的致病病毒之一，可侵入機(jī)體內(nèi)肝臟、中樞及泌尿等系統(tǒng)，誘發(fā)諸多不良病變，可阻滯機(jī)體免疫功能，引起諸多疾病，對(duì)機(jī)體正常功能造成極大影響，甚至可引起死亡[2]。CMV對(duì)人體具有感染作用，僅在侵入人體纖維細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)增殖，但可經(jīng)諸多途徑進(jìn)行傳播，對(duì)人體危害性較大。

3.2 T淋巴細(xì)胞的分類及作用

T淋巴細(xì)胞是多功能干細(xì)胞之一，來(lái)源于骨髓，可于胸腺激素作用下進(jìn)行分化成具有諸多功能的免疫T細(xì)胞，并在機(jī)體正常免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[3]。根據(jù)免疫功能的不同，可將T淋巴細(xì)胞分為效應(yīng)性T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞等亞群，多種T細(xì)胞亞群之間通過(guò)相互協(xié)調(diào)以共同維持機(jī)體正常免疫功能[4]。

3.3 CMV感染致肝炎患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平及其與CMV載量的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，病例組患兒外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著降低。此外，本研究中，低載量組外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表達(dá)水平較中載量組均顯著升高，較高載量組亦均顯著升高，中載量組外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表達(dá)水平較高載量組均顯著升高；其次，本研究經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CMV載量與CD3、CD4及CD4/CD8均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(均P<0.01)。外周血CD3、CD4、CD8 T淋巴細(xì)胞亞群分別是淋巴細(xì)胞免疫中的輔助性、效應(yīng)性及毒性細(xì)胞，且CD4/CD8比值可用于反映細(xì)胞免疫功能的狀況。CMV在感染患兒機(jī)體后，主要通過(guò)分泌毒性物質(zhì)以促進(jìn)抑制免疫效應(yīng)性和輔助性細(xì)胞因子，一方面可阻滯調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖，促使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用減弱[5]。另一方面可間接阻滯活性因子對(duì)T淋巴細(xì)胞CD3和CD4亞群的激活作用，導(dǎo)致機(jī)體T細(xì)胞分化成熟時(shí)出現(xiàn)異常，促使機(jī)體CD3和CD4 T淋巴細(xì)胞亞群的水平下降，進(jìn)一步導(dǎo)致其對(duì)機(jī)體免疫功能的效應(yīng)與輔助作用減弱，減輕機(jī)體殺傷性免疫細(xì)胞對(duì)CMV的殺傷作用[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，病例組與對(duì)照組CD8水平的比較，并無(wú)明顯差異；并且不同CMV載量組的肝炎患兒CD8水平的比較并無(wú)明顯差異。此外，本研究經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CMV載量與CD8的水平并無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。CD8 T淋巴細(xì)胞亞群是毒性細(xì)胞之一，其主要作用在于阻滯和促使受感染細(xì)胞凋亡。在CMV感染機(jī)體時(shí)，受感染細(xì)胞增多，而CD8細(xì)胞亦會(huì)隨之增多[7]，但因CMV具有阻滯調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用，使得機(jī)體免疫功能出現(xiàn)異常，繼而導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)CD8細(xì)胞的活性作用，使得CD8細(xì)胞的表達(dá)水平有所降低[8]，所以病毒性肝炎患兒CD8細(xì)胞的表達(dá)水平雖有所變化，但變化幅度不大。

綜上所述，CMV感染性肝炎可阻滯患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4及CD4/CD8的水平，使得患兒免疫功能下降，CMV可阻滯外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD3與CD4細(xì)胞增殖，而對(duì)CD8淋巴細(xì)胞的影響較小，故此臨床中應(yīng)及時(shí)測(cè)定肝炎患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群，尤其是CD3和CD4的表達(dá)水平。

[專業(yè)責(zé)任編輯：吳紅艷]