趙 花 ，寧科迪 ，魏建華，曹立軍 ，高 峰 (.吉林人參研究院，通化3400;.通化市寧式骨科醫(yī)院，通化3400）

葛根為豆科植物野葛pueraria lobata (Willd.)O-hwi的干燥根。習(xí)稱野葛。秋、冬二季采挖，趁鮮切成厚片或小塊；干燥。

葛根是最為常用的中藥之一，也是屬于藥食同源的植物。具有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，舒經(jīng)活絡(luò)，解酒毒等功效[1]。葛根中的有效成分主要是黃酮類，如葛根素、3-甲氧基葛根素、3-羥基葛根素，大豆苷等，其中還含有蛋白質(zhì)、生物堿以及大量的纖維素、淀粉、果膠等多糖物質(zhì)。最近，葛根黃酮提取物以及葛根素被發(fā)現(xiàn)有改善骨代謝的作用，有可能適用于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[2～3]。

1 原料、試劑和儀器

1.1 葛根原料

在GSP認(rèn)證的山東山水中藥飲片有限公司購買。

1.2 試劑

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品，吉林省藥品檢驗(yàn)所；95%乙醇，沈陽市華東有限公司。

1.3 儀器

TU-1901雙光束紫外可見分光光度；2A型手提式多功能粉碎機(jī)；德國BP211DSartourius電子天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，型號RE-52AA；SHZ-C型循環(huán)式多用真空泵。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 曲線的制作

葛根總黃酮的分析方法采用分光光度法，葛根素的對照品在紫外區(qū)250nm處獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。因此，直接采用分光光度法在紫外區(qū)250nm處測定溶液的吸光度。

準(zhǔn)確稱取5.5mg葛根素對照品，用95%乙醇溶解并定容于50ml容量瓶中，得到0.11mg/ml的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次精密吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml于 10ml容量瓶中，蒸餾水稀釋定容，得到系列對照品溶液。以250nm處測定對照品溶液的吸光度。得到吸光度A與總黃酮質(zhì)量濃度C(mg/ml)的線性關(guān)系，見圖1。

經(jīng)計(jì)算得回歸方程為：

Y=2.86032×C+0.02178，相關(guān)系數(shù) R2=0.9985。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度的考察

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理（干燥恒重）的葛根藥材4份，每份1g，分別加入100ml的 10%、30%、50%、70%的乙醇溶液，于80℃條件下加熱回流提取120min，將提取液減壓抽濾，定容至100ml。

精密吸取1ml濾液，放入10ml容量瓶中加入不同濃度的乙醇定容至刻度線，在250nm處測定吸光度，見圖2。

提取溶劑 10%乙醇 40%乙醇 50%乙醇 70%乙醇葛根總黃酮得率% 6.075 6.300 5.659 5.608

由圖2可知，葛根總黃酮的得率都是隨著乙醇濃度的增大逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)，得率達(dá)到最高，之后葛根總黃酮得率呈下降趨勢。因此，本實(shí)驗(yàn)選取40%乙醇溶液作為提取溶劑。

2.2.2 提取時(shí)間的考察

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理（干燥恒重）的葛根藥材5份，每份1g，40%乙醇溶液，于80℃條件下分別加熱回流提取 30min、60min、90min、120min、150min 將提取液減壓抽濾，定容至100ml。

精密吸取1ml濾液，放入10ml容量瓶中加入40%的乙醇定容至刻度線，在250nm處測定吸光度，見圖3。

提取時(shí)間（min） 30 60 90 120 150葛根總黃酮得率% 5.76 5.85 5.98 6.24 6.02

由圖3可知，葛根總黃酮的得率都是隨著提取時(shí)間的延長而逐漸增加，提取時(shí)間為120min時(shí)，得率達(dá)到最高，之后葛根總黃酮得率呈下降趨勢。因此，本實(shí)驗(yàn)選取最佳的提取時(shí)間為120min。

2.2.3 提取溫度的考察

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理（干燥恒重）的葛根藥材4份，每份1g，加入25倍量的40%乙醇溶液，分別在60℃，70℃，80℃，90℃條件下回流提取120min，將提取液減壓抽濾，定容至100ml。

精密吸取1ml濾液，放入10ml容量瓶中加入40%的乙醇定容至刻度線，在250nm處測定吸光度，見圖4。

提取溫度（℃） 60 70 80 90葛根總黃酮得率% 6.52 6.61 6.83 6.70

由圖4可知，葛根總黃酮的得率都是隨著提取時(shí)間的延長而逐漸增加，提取溫度為80℃，得率達(dá)到最高，之后葛根總黃酮的得率呈下降趨勢。因此，本實(shí)驗(yàn)選取最佳的提取溫度為80℃。

2.2.4 溶劑用量的考察

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理（干燥恒重）的葛根藥材4份，每份1g，分別加入20倍，25倍，30倍，35倍量的40%乙醇溶液，于80℃條件下加熱回流提取120min將提取液減壓抽濾，定容至100ml。

精密吸取1ml濾液，放入10ml容量瓶中加入40%的乙醇定容至刻度線，在250nm處測定吸光度，見圖5。

溶劑用量（倍） 20 25 30 35葛根總黃酮提取率% 6.55 6.71 6.65 6.60

圖5可知，葛根總黃酮的得率都是隨著溶劑用量的增大而逐漸增加。當(dāng)溶劑用量為30倍時(shí)，得率呈下降趨勢。因此，從本實(shí)驗(yàn)選取25倍量作為溶劑用量。

2.2.5 提取次數(shù)的考察

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理（干燥恒重）的葛根藥材3份，每份1g，分別加入25倍40%的乙醇溶液，于80℃條件下分別加熱回流提取1次、2次、3次，每次120min，將提取液減壓抽濾，合并提取液定容至100ml。

精密吸取1ml濾液，放入10ml容量瓶中加入40%的乙醇定容至刻度線，在250nm處測定吸光度，見圖6。

提取次數(shù)（次） 1 2 3葛根總黃酮得率（%） 6.06 6.26 6.12

由圖6可知，葛根總黃酮的得率都是隨著提取次數(shù)的增多而逐漸減少。因此，本實(shí)驗(yàn)選取最佳提取次數(shù)為2次。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、各因素水平設(shè)置及數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，提取時(shí)間，提取溫度，溶劑用量，提取次數(shù)對葛根總黃酮得率有影響，因此采用正交實(shí)驗(yàn)法將每個(gè)因素選三水平進(jìn)行，因素及水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 方差分析Table 2 Variance analysis

表3 正交實(shí)驗(yàn)表 L9（34）Table 3 The orthogonal experiment table L9（34）

以葛根總黃酮的得率為指標(biāo)，從表2中極差的大小及表3方差分析結(jié)果上看，各因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果法的影響依次為C(提取溫度)＞D(提取次數(shù))＞A(提取時(shí)間)＞B(溶劑用量)。其中提取溫度對葛根總黃酮的得率有顯著性影響。

3 結(jié)果與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析得出，以40%乙醇為溶劑提取葛根中葛根總黃酮的最佳組合條件為：A2B2C2D2，即提取時(shí)間120min，溶劑用量25倍，提取溫度80℃，提取次數(shù)2次。

3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證優(yōu)化工藝條件的穩(wěn)定性，分別按照下列條件進(jìn)行了三組穩(wěn)定性試驗(yàn)。提取時(shí)間120min，溶劑用量25倍，提取溫度80℃，提取次數(shù)2次。對葛根總黃酮含量進(jìn)行測定，結(jié)果葛根中總黃酮含量分別為：8.99%，8.91%，8.95%，平均值 8.95%，大于正交設(shè)計(jì)中的含量，并且具有良好的重復(fù)性和較高的準(zhǔn)確率，所篩選的提取工藝條件基本穩(wěn)定，可作為葛根總黃酮的提取方法。