白玉潔 ，鄭斯文 ，鄭厚勝 ，逄世峰 ，王英平 *

（吉林農業(yè)大學中藥材學院，長春130118；2.中國農業(yè)科學院特產研究所，長春130112）

人參（Panax ginseng C.A.Mey）為五加科人參屬植物，微溫、甘、微苦，具有大補元氣、補脾益肺、復神益智等功效[1]。主要分布在中國、韓國等地?，F代藥理實驗表明，人參具有調節(jié)血糖[2]、促進造血功能[3]、抗疲勞抗氧化[4]、增強免疫力[5，6]的作用。生曬參為人參的主要炮制品，其主要活性成分主要是人參皂苷與人參多糖，但現在對于生曬參提取物免疫活性研究較少。環(huán)磷酰胺是治療惡性腫瘤最常用的烷化劑代表藥物，具有廣譜的抗癌作用，同時還具有較強的免疫抑制作用，可以嚴重抑制小鼠免疫功能[7～9]。本實驗以環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑，研究生曬參不同提取物對免疫功能低下小鼠的免疫調節(jié)作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

雄性 SPF級 BALB/c小鼠，體重 20±2 g，購于長春億斯實驗動物技術有限責任公司，實驗動物許可證號SCXK（吉）2017-0005。小鼠自由飲食飲水，室溫23.0～25.0℃，濕度55%～65%，適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗。

1.2 藥物與試劑

生曬參購于集安康美新開河（吉林）藥業(yè)有限公司，經吉林省參茸辦公室馮家研究員鑒定為5年生五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey）的根；環(huán)磷酰胺（江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司）；刀豆蛋白、紅細胞裂解液、紅細胞保存液 （索萊寶生物科技有限公司）；Enhanced Cell Counting Kit-8 （CCK-8）（上海碧云天生物技術有限公司）；無支原體胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)基 （美國 Hyclone公司）；白細胞稀釋液（江蘇建成科技有限公司）；IFN-γ、TNF-α試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司）。

1.3 儀器設備

KDC-40低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；ZHJH-C1115C智能安全型超凈工作臺 （上海智城分析儀器制造有限公司）；BB150二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；水浴鍋（常州潤華電器有限公司）；電子微量天平（上海越平科學儀器有限公司）；酶標儀（美國Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 樣品的制備

生曬參醇提物：生曬參切片，75%酒精醇提，過濾后合并濾液，旋蒸得浸膏，得率為30%，含水量為30.36%，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

生曬參水提物：生曬參切片，50℃恒溫水提，料液比為1∶5，提取時間5h，提取 3次，過濾后合并濾液，旋蒸得浸膏，得率為37.5%，含水量為60.22%，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2.2 動物分組、造模及給藥

實驗分3批進行，每批雄性BALB/c小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。設立正常對照組，灌胃（Introgastric，ig）生理鹽水，模型組（ig 生理鹽水），陽性對照組（ig鹽酸左旋咪唑40 mg/kg），醇提物組（ig醇提物 340mg/kg），水提物組（ig 水提物 800mg/kg），除正常對照組外，其余各組于灌胃后25 d開始腹腔注射CTX（80 mg/kg），連續(xù)注射5d，建立小鼠免疫功能低下模型。造模期間正常灌胃給藥，累計灌胃30 d。

2.3 小鼠免疫器官指數的測定

小鼠于末次注射CTX后24h，稱量小鼠體重，頸椎脫臼處死，解剖，取胸腺及脾臟，剝除周圍結締組織，生理鹽水沖洗殘血后濾紙吸去多余液體，稱量其重量并記錄。

2.4 小鼠外周血白細胞數的測定

小鼠于末次注射CTX后24h，小鼠眼球靜脈叢采血于抗凝劑中，混勻，取20 μL于0.38 mL的白細胞稀釋液中，混勻，顯微鏡下計算白細胞數。

2.5 細胞免疫

2.5.1 小鼠脾淋巴細胞增殖反應

2.5.1.1 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備

各組小鼠于末次注射CTX24h后，頸椎脫臼處死后，超凈臺內無菌取脾，去除結締組織及脂肪，用大號注射器芯研磨，過200目篩網，制成單細胞懸液。臺盼藍染色后進行活細胞計數（95%以上），10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液調細胞濃度為3×106個/mL。

2.5.1.2 ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖實驗

本實驗采用CCK-8法測定小鼠淋巴細胞增殖程度。調細胞濃度為3×106個/mL。設對照孔：脾細胞懸液 100μL；刺激孔：脾細胞懸液 100μL加 conA（終濃度為 5μg/mL）； 空白孔：1640 完全培養(yǎng)液 100μL。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育68h后，每孔加CCK-8顯色劑10μL，繼續(xù)孵育1h，在450nm下測吸光度值。淋巴細胞增值率用刺激指數SI來表示。

SI=對照孔/刺激孔

2.5.2 遲發(fā)型變態(tài)反應 （DTH）

2.5.2.1 綿羊紅細胞（SRBC）

綿羊頸靜脈取血，將羊血放入盛有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個方向搖動10min，以脫纖維，靜置后用生理鹽水洗滌3次 （3500r/min，10min），制備壓積SRBC。

2.5.2.2 致敏

小鼠于檢測前4d，以2%（v/v）SRBC腹腔注射致敏，每只 0.2mL（約 1×108 個 SRBC）。

2.5.2.3 DTH的產生與測定

采用足趾增厚法測定。4d后，用游標卡尺測量小鼠左側足趾厚度，測量3次，取平均值，并在測量處注射 20%（v/v）SRBC 20μL，24h 后再次測量小鼠足趾厚度 ，測量3次，取平均值。以攻擊前后足趾厚度的差值來表示DTH的程度。

2.6 單核-巨噬細胞功能測定

2.6.1 小鼠碳廓清實驗

小鼠末次注射CTX24h后，小鼠尾靜脈注射4倍稀釋后的印度墨汁（0.1mL/10g），注射完成后立即計時。在注射后2min、10min時分別采血，立即取20μL加至2mL0.1%Na2CO3中，混勻，在600nm處測波長；并解剖小鼠，取肝、脾并稱重。以吞噬指數a表示小鼠碳廓清能力。

2.7 細胞因子的測定

各組小鼠于末次給藥24h后，小鼠摘眼球取血，離心，得到小鼠血清樣本，采用ELISA的方法按試劑盒說明書中操作方法檢測IFN-γ、TNF-α的含量。

2.8 統(tǒng)計學處理

用DPS統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計，實驗數據以均值（x ）±標準差（s）表示，兩兩比較采用 LSD 法，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 生曬參不同提取物對免疫功能低下小鼠器官指數及白細胞數的影響

如表1所示，與正常對照組比較，模型組小鼠器官指數及白細胞數顯著降低 （P<0.01）。與模型組比較，生曬參醇提物、水提物可以明顯提高小鼠脾指數與白細胞數（P<0.05，P<0.01）。

表1 生曬參不同提取物對免疫功能低下小鼠器官指數及白細胞數的影響 （x±s，n=10）

3.2 生曬參不同提取物對免疫功能低下小鼠細胞免疫的影響的影響

如表2所示，與正常對照組比較，模型組小鼠脾淋巴細胞增值能力與小鼠足趾厚度顯著降低 （P<0.01）。與模型組比較，生曬參醇提物與水提物可以明顯提高小鼠脾淋巴細胞增值能力與遲發(fā)型變態(tài)反應。（P<0.05，P<0.01）。

表2 生曬參不同提取物對免疫功能低下細胞免疫的影響 （x±s，n=10）

3.3 生曬參不同提取物對單核-巨噬細胞能力的影響

如表3所示，與正常對照組比較，模型組小鼠碳廓清顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，生曬參醇提物、水提物可以明顯提高小鼠碳廓清能力（P<0.05，P<0.01）。

表3 生曬參不同提取物對免疫功能低下單核-巨噬細胞免疫的影響 （x±s，n=10）

3.3 生曬參不同提取物對IFN-γ與TNF-α含量的影響

如表4所示，與正常對照組比較，模型組小鼠IFN-γ與TNF-α含量顯著降低 （P<0.01）。與模型組比較，生曬參醇提物、水提物可以明顯提高小鼠IFN-γ 與 TNF-α 含量（P<0.05，P<0.01）。

表3 生曬參不同提取物對免疫功能低下IFN-γ與TNF-α 含量的影響（x±s，n=10）

4 討論與結論

CTX作為免疫抑制劑，大量實驗研究表明CTX可以造成動物的免疫抑制[7～9]。胸腺與脾是機體重要的免疫器官，對調節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用[10]，本實驗結果表明CTX可致小鼠免疫器官萎縮，生曬參醇提物與水提物可以明顯增強小鼠脾指數。脾淋巴細胞增殖能力與遲發(fā)型變態(tài)反應可以反應小鼠細胞免疫功能，脾淋巴細胞增殖能力是評價T淋巴細胞功能的重要指標[11]，結果表明生曬參醇提物與水提物可以不同程度提高小鼠脾淋巴細胞增殖能力與遲發(fā)型變態(tài)反應。巨噬細胞作為體內固有免疫的主要組成部分，可以吞噬與清除異物，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用[12]，碳廓清能力可以反應小鼠單核-巨噬細胞功能，醇提物與水提物可以明顯提高小鼠碳廓清能力。IFN-γ是體內參與免疫反應的細胞因子，還可以介導炎癥反應與遲發(fā)型變態(tài)反應，TNF-α主要由巨噬細胞分泌，能夠刺激NK細胞發(fā)揮作用，在宿主防御過程中發(fā)揮著重要作用[13]，結果發(fā)現生曬參醇提物與水提物可以明顯提高小鼠TNF-α與IFN-γ含量。本實驗研究發(fā)現，生曬參醇提物與水提物對免疫功能低下小鼠發(fā)揮免疫調節(jié)作用，且生曬參水提物的免疫活性優(yōu)于醇提物。