毓志超

（廣州智匯生物科技有限公司，廣東 廣州 510670）

在市售的各類保健品中，減肥類保健品一直占據(jù)著比較大的市場份額。在各類減肥保健品中，含有的非法添加的有害物質(zhì)，以合成食欲抑制劑最為常見。食欲抑制劑主要包括：芬氟拉明（fenfluramine，F(xiàn)EN）、苯丁胺 （phentermine，PHE）、氯苯丁胺 （chlorphentermine，CPT）、苯甲嗎啡 （phenmetrazine，PHM） 和安非潑拉酮（anfepramone，AFP）等。國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了關(guān)于停止生產(chǎn)、銷售和使用鹽酸芬氟拉明原料藥和制劑的通知（國食藥監(jiān)辦 [2009]19號）。

目前，分析檢測這類食欲抑制劑的方法以各種色譜技術(shù)為主，包括 HPLC（APCI-MS）、LCMS/MS及GC/MS等。但這些方法檢測的對象大都是尿樣、血樣或組織等生物樣品及藥物片劑，主要應(yīng)用于法醫(yī)、毒理、臨床及制藥等領(lǐng)域，對于基質(zhì)復(fù)雜的保健品分析缺少一定的針對性。本實驗對非法添加違禁藥物芬氟拉明的快速檢測方法，先采用水初步提取，加入鹽酸溶液構(gòu)造酸性反應(yīng)環(huán)境；然后加入對硝基苯胺及亞硝酸鈉，利用亞硝酸離子在酸性介質(zhì)中與對硝基苯胺發(fā)生重氮化反應(yīng)；再加入適量的氫氧化鈉溶液中和過量的酸，調(diào)節(jié)適宜的pH環(huán)境；再然后在該環(huán)境中使重氮對硝基苯胺可與目標物質(zhì)芬氟拉明偶聯(lián)，生成紅色偶氮化合物；最后用正丁醇進行萃取提取，振搖、靜置，可以使得到的上層溶液顏色更易觀察。并根據(jù)經(jīng)萃取后的上清溶液顏色即可判斷樣品中是否非法添加了違禁藥物芬氟拉明：若上層溶液顯紅色，則判為陽性（不合格產(chǎn)品，非法添加了違禁藥物芬氟拉明），若為透明或其他現(xiàn)象判為陰性（合格產(chǎn)品）。該方法更環(huán)保，更快速、準確，顯色明顯且靈敏度高，操作簡便，適應(yīng)性范圍廣[1-3]。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

旋渦混勻器、離心機、超聲波清洗機。

1.2 試劑及溶液配制

鹽酸芬氟拉明（美國sigma公司）；鹽酸（分析純）；對硝基苯胺（分析純）；亞硝酸鉀（分析純）；亞硝酸鈉（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；氫氧化鉀（分析純）；碳酸鈉（分析純）；碳酸鉀（分析純）；正丁醇（分析純）；三氯甲烷（分析純）；石油醚（分析純）。

1.3 材料

保健品基質(zhì)模擬樣品（膠囊、片劑、茶、點心、口服液），樣品均為市售的減肥保健品。

1.4 檢測方法

1）取待測樣品，加入水和試劑A，振搖，離心或靜置。

2）取離心液或靜置后的上層清液，加入試劑B和試劑C，輕搖，繼續(xù)加入試劑D和試劑E，振搖，靜置，觀察靜置分層后上層溶液的顏色。

A為鹽酸溶液、硫酸溶液和冰乙酸中的一種或幾種；B為對硝基苯胺水溶液；C為亞硝酸鈉溶液和亞硝酸鉀溶液中的一種或兩種；D為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉和碳酸鉀中的一種或幾種；E為正丁醇、氯仿和石油醚中的一種或幾種。

步驟1） 中，每1.5～3g待測樣品中加入2～4mL水和0.8～1.2mL試劑A。

取待測樣品，加入水和試劑A后，然后振搖20～40s，再在 2500～6000r/min 的轉(zhuǎn)速下離心 1～2min 或靜置 30～60s。

待測樣品為硬膠囊內(nèi)容物、軟膠囊內(nèi)容物、片劑、丸劑或散劑；水為純凈水、去離子水或蒸餾水。

步驟2）中，每2mL離心液或上層清液中加入 0.8～1.2mL 試劑 B、1～1.5mL 試劑 C、0.8～1.2mL試劑D和1.6～2.4mL試劑E。

取離心液或靜置后的上層清液，加入試劑B和試劑C，輕搖10～20s；然后繼續(xù)加入試劑D和試劑E，振搖30～60s，再靜置2～5min。A為鹽酸溶液，C為亞硝酸鈉溶液，D為質(zhì)量分數(shù)2.5%的氫氧化鈉，E為正丁醇。

1.5 前處理方法比較

1）上述試劑A采用鹽酸溶液，優(yōu)化為1mol/L的鹽酸溶液。需要說明的是，當試劑A采用鹽酸溶液時，更容易回收，且回收率最高，達89%；當試劑A采用硫酸溶液時，回收率為30%；當試劑A采用冰乙酸時，回收率為76%；當試劑A采用鹽酸溶液和硫酸溶液的混合物時，回收率為35%；當試劑A采用鹽酸和冰乙酸的混合物時，回收率為80%；當試劑A采用硫酸溶液和冰乙酸的混合物時，回收率為34%。

2)取離心液或靜置后的上層清液，加入試劑B和試劑C，輕搖，繼續(xù)加入試劑D和試劑E，振搖，靜置，觀察靜置分層后上層溶液的顏色。若上層溶液顯紅色，則判為陽性（不合格產(chǎn)品，非法添加了違禁藥物芬氟拉明），若為透明或其他現(xiàn)象判為陰性（合格產(chǎn)品）。

優(yōu)選為：每2mL離心液或上層清液中加入0.8～1.2mL 試劑 B、1～1.5mL 試劑 C、0.8～1.2mL試劑D和1.6～2.4mL試劑E。

取離心液或靜置后的上層清液，加入試劑B和試劑C，輕搖10～20s；然后繼續(xù)加入試劑D和試劑 E，振搖 30～60s，再靜置 2～5min。

需要說明的是，本方法中試劑B采用質(zhì)量分數(shù)為1%的硝基苯胺水溶液。

由于亞硝酸鈉與亞硝酸鉀均可提供反應(yīng)需要的亞硝酸根離子，但亞硝酸鈉更容易制備得到，且制備成本較亞硝酸鉀更低。本方法的試劑C優(yōu)選采用質(zhì)量分數(shù)為1.5%～2.5%的亞硝酸鈉溶液。

在陰離子相同的情況下，陽離子與水分子的結(jié)合能，與電荷量成正比，與半徑成反比，而Na+和K+相比，Na+更容易與水分子結(jié)合，導(dǎo)致影響稱量的準確度，甚至變潮溶解而無法實驗。本實驗的試劑D優(yōu)選為質(zhì)量分數(shù)為2.5%的氫氧化鉀溶液。

本實驗的試劑E優(yōu)選采用正丁醇，正丁醇穩(wěn)定，毒性小，同時交易獲得，適合大量使用，且提取反應(yīng)效率較高。

2 結(jié)語

本實驗先采用水初步提取，加入鹽酸構(gòu)造酸性反應(yīng)環(huán)境，然后加入對硝基苯胺及亞硝酸鈉，利用亞硝酸離子在酸性介質(zhì)中與對硝基苯胺發(fā)生重氮化反應(yīng)；再加入適量的氫氧化鈉溶液中和過量的酸，調(diào)節(jié)適宜的pH環(huán)境，當待測樣品中非法添加了違禁藥物芬氟拉明，則在該環(huán)境中重氮對硝基苯胺能夠與目標物質(zhì)芬氟拉明偶聯(lián)，生成紅色偶氮化合物，若待測樣品中未添加違禁藥物芬氟拉明，則不會發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，即不會有紅色偶氮化合物產(chǎn)生；最后用正丁醇進行萃取提取，再振搖、靜置，可以使得到的上層溶液顏色更易觀察。因此，根據(jù)上清溶液顏色即可判斷樣品中是否非法添加了違禁藥物芬氟拉明，若上層溶液顯紅色，則判為陽性（不合格產(chǎn)品，非法添加了違禁藥物芬氟拉明），若上層溶液為透明或其他現(xiàn)象判為陰性（合格產(chǎn)品，未添加違禁藥物芬氟拉明）。