許欽坤，趙翠燕

（1.韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東 韶關(guān)512005；2.韶關(guān)學(xué)院 英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 韶關(guān)512005）

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌是導(dǎo)致人畜腹瀉的主要病原菌.目前，防治這類細(xì)菌性疾病主要使用抗生素，而抗生素的濫用加劇了細(xì)菌的抗藥性，嚴(yán)重威脅到人類健康.由于中草藥具有來源廣泛、不易產(chǎn)生耐藥性且毒副作用較小的特點(diǎn)，因此目前備受關(guān)注.金銀花是忍冬科多年生常綠纏繞灌木忍冬的干燥花蕾［1］，主要含有揮發(fā)油類、黃酮類、酚酸類、三萜類等成分, 其中酚酸類成份具有較好的抑菌效果［2-4］.金銀花性味甘寒, 氣味芳香，入肺經(jīng)、心經(jīng)和胃經(jīng)；甘寒清熱而不傷胃， 芳香透達(dá)又可祛邪；既能疏散風(fēng)熱, 亦能清解血毒，用于身熱、發(fā)斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等熱性病的治療, 且效果顯著［5-6］，因此金銀花在臨床上和動(dòng)物養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用.本實(shí)驗(yàn)以金銀花作為研究對(duì)象，分別對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，以期為這些細(xì)菌性疾病的臨床防治提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

金銀花購自韶關(guān)市某藥房.大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌菌為實(shí)驗(yàn)室保存.主要儀器包括恒溫培養(yǎng)箱、牛津杯、冰箱、高壓蒸汽滅菌鍋和無菌操作臺(tái)等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備

無菌條件下，分別將4 種病原菌接種至斜面培養(yǎng)基，37 ℃，倒置培養(yǎng)過夜；挑選單個(gè)菌落，接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min，搖床培養(yǎng)過夜；調(diào)節(jié)菌種濃度到1×105CFU/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 金銀花提取物的制備［7］

取50 g 金銀花，加蒸餾水500 mL.室溫浸泡1 h 后煮沸，煮沸后文火煎煮1 h，8 層紗布過濾；濾渣加水250 mL，煮沸30 min，合并2 次濾液，水浴濃縮至50 mL，即藥液濃度為l g／mL ，裝于三角瓶中，高壓蒸汽滅菌，4 ℃冰箱中保存，備用.

1.2.3 牛津杯法體外抑菌實(shí)驗(yàn)［8］

在無菌條件下，將滅菌過的培養(yǎng)基制成平板，待其冷卻凝固后，分別加入0.1 mL 供試菌，用無菌玻璃涂棒涂布均勻.待干燥后，用鑷子將牛津杯放入培養(yǎng)平板中，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸沒有空隙，每個(gè)平板水平擺放4 個(gè)牛津杯.牛津杯中加入藥液，做3 組對(duì)照.將平板倒置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，判斷藥液的抑菌作用.

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用試管2 倍稀釋法，取10 支滅菌試管，放置試管架，編號(hào).每個(gè)試管加2 mL 無菌液體培養(yǎng)基，取金銀花提取藥液2 mL 加入1 號(hào)試管，混和均勻；取出2 mL 放2 號(hào)試管，依次類推，稀釋至9 號(hào)試管，第9號(hào)試管取2 mL 棄掉.藥物稀釋度依次為1∶2、1∶4、1:8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512.取保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌菌液0.1 mL，分別加到上述試管中，混合均勻， 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置24 h，觀察結(jié)果并記錄各試管內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)情況.如果試管中完全清亮，無細(xì)菌生長(zhǎng)，則說明此藥物的濃度為最小抑菌濃度(MIC).同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照管和陰性對(duì)照管各1 支.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 金銀花提取物的抑菌效果

抑菌效果判定：抑菌圈直徑15 mm 以上為高度敏感，10~15 mm 為中度敏感，小于10 mm 為低度敏感.金銀花提取物對(duì)4 種病原菌的抑菌結(jié)果，如表1 所示.

表1 金銀花提取物對(duì)4 種病原菌抑菌結(jié)果

由表1 可知，沙門氏菌對(duì)金銀花提取物有較強(qiáng)敏感性，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對(duì)金銀花提取物中度敏感，銅綠假單胞菌對(duì)金銀花提取物低度敏感.

2.2 金銀花提取物的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果

由表2 可以看出，金銀花提取物對(duì)4 種病原菌有較好抑菌作用，其中對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果最強(qiáng)，MIC 值為31.20 mg／mL，對(duì)沙門氏菌的抑菌活性次之，MIC 值為125.00 mg／mL，對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性最弱，MIC 值為250.00 mg／mL.

表2 金銀花提取物對(duì)4 種病原菌最小抑菌濃度(MIC)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，金銀花提取物對(duì)4 種病原菌均有較好的抑菌作用，沙門氏菌對(duì)金銀花提取物有較強(qiáng)敏感性，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對(duì)金銀花提取物中度敏感，銅綠假單胞菌對(duì)金銀花提取物低度敏感.其中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC）均為31.25 mg/mL.沙門氏菌最小抑菌濃度（MIC）為125.00 mg/mL，銅綠假單胞菌最小抑菌濃度（MIC）為250.00 mg/mL.這與姜源明［9］和任敏［10］的研究結(jié)果基本符合，但抑菌強(qiáng)度有所差別，這可能和藥物提取方式，濃度以及菌體濃度有關(guān).

我國中草藥資源十分豐富，種類多，數(shù)量大.已有研究證明，很多中草藥的提取物中含有殺菌，抗病毒成分.金銀花是常用中草藥之一，在臨床上對(duì)常見致病菌有抑菌和殺菌作用［11-12］，林小靜等［13］研究發(fā)現(xiàn)金銀花主要成分對(duì)銅綠假單胞菌多耐藥菌株較強(qiáng)的抑菌作用. 在動(dòng)物養(yǎng)殖中, 金銀花提取物可作為抗生素替代品，具有治愈率高、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥等特點(diǎn)，有著極其廣闊發(fā)展應(yīng)用前景.