陳榮芳，余碩，周良燚，張學(xué)榮，戴秋云

1.廣西醫(yī)科大學(xué) 蛇毒研究所，廣西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧530021；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071

α芋螺毒素MI 來自幻芋螺（Conus magus），其氨基酸序列為GRCCHPACGKNYSC-NH2[1]，含2 對(duì)二硫鍵（連接方式為Cys3-Cys8，Cys4-Cys14[2]）。MI 作用于肌肉型煙堿乙酰膽堿受體，對(duì)小鼠的半數(shù)致死劑量約10 μg/kg（腹腔注射）[2-4]，我們實(shí)測(cè)為15～20 μg/kg，是目前發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的芋螺毒素。MI 可導(dǎo)致中毒對(duì)象肌肉癱瘓及麻木，呼吸困難，心肌損害，心搏停止乃至死亡[1]。

目前MI 中毒無有效治療藥物，也未見MI的抗毒血清報(bào)道，僅見結(jié)構(gòu)相似的α芋螺毒素GI 抗血清對(duì)MI的解毒效果報(bào)道[5]。GI與孔藍(lán)蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)后免疫山羊，制備的抗血清對(duì)GI 及MI的保護(hù)活性不高[5]。本實(shí)驗(yàn)室開展了GI-BSA（牛血清蛋白）偶聯(lián)物免疫后制備的小鼠抗血清工作，發(fā)現(xiàn)GI 抗血清對(duì)GI 中毒小鼠有一定的保護(hù)作用，但活性仍不高[6]。其原因可能是α芋螺毒素GI 通過戊二醛偶聯(lián)蛋白載體時(shí)反應(yīng)位點(diǎn)多，影響了GI的抗原表位，導(dǎo)致抗血清活性不高。

多抗原肽系統(tǒng)（multiple antigen peptide sys?tem，MAPs）由小的核心基質(zhì)與圍繞核心基質(zhì)的高密度抗原肽形成，與常規(guī)的肽-載體蛋白相比抗原密度更高，免疫原性增強(qiáng)，已用于多肽抗體及疫苗的研發(fā)[7-8]。為制備MI 抗血清，我們采用點(diǎn)擊反應(yīng)制備了MI 多分支肽，保持MI 抗原表位的完整性，然后免疫小鼠，測(cè)定其抗體滴度與抗毒活性。結(jié)果表明，成功制備了MI 八分支抗原，但其免疫抗原性較低，抗血清的抗毒活性不佳。

1 材料與方法

1.1 材料

KM 小鼠（雌雄各半，18～20 g）及BALB/c 小鼠（雌性，5周齡，17～19 g）購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司）。有機(jī)合成用試劑9-芴甲氧琥珀酰亞胺基碳酸酯（Fmoc-OSu）、三異丙基硅烷（TIS）、三[（1-芐基-1H-1，2，3-三唑-4-基）甲基]胺（TBTA）、抗壞血酸鈉、Boc-Lys-OH、3-丁炔-1-醇、三光氣等購自北京伊諾凱科技有限公司。多肽固相合成用試劑Rink 樹脂（取代率0.6 mmol/g）購自天津南開合成有限公司，F(xiàn)moc 保護(hù)氨基酸、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）、1-羥基苯并三唑（HoBt）等購自上海吉爾生化有限公司，二甲基甲酰胺（DMF）、哌啶、二氯甲烷（DCM）、無水甲醇（MeOH）、無水乙醚等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，二異丙基二乙胺（DIEA）、三氟乙酸（TFA）等購自北京伊諾凱有限公司。ELISA檢測(cè)試劑辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗體、TMB 底物顯色試劑盒等購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA 公司）；循環(huán)水式真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；多肽固相合成儀（德國Zinsser analytic 公司）；凍干機(jī)（德國Christ 公司）；Waters 625 高效液相色譜儀（Waters公司）；安捷倫1200 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；核磁共振儀（日本JEOL 公司）；mi?croTOF QII 質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 Fmoc-Lys（butynyl）-OH 合成

按文獻(xiàn)[9]先合成Boc-Lys（butynyl）-OH，再用4 mol/L HCl 脫去保護(hù)基，所得白色固體（2.38 g，9.83 mmol）和碳酸鈉（1.04 g，9.83 mmol）溶于30 mL 四氫呋喃（THF）水溶液中（THF∶水=2∶1），冰浴冷卻后，緩慢滴加Fmoc-OSu（3.31 g，9.83 mmol）THF 溶液（10 mL）。室溫?cái)嚢柽^夜，反應(yīng)完成后旋去THF，乙酸乙酯萃取4～5 次，無水硫酸鈉干燥，旋蒸后經(jīng)硅膠柱純化，獲得3.52 g Fmoc-Lys（butynyl）-OH。

1.3 MI 多分支抗原的合成

C端連接的MI 多分支抗原合成路線見圖1，N端連接的MI 多分支抗原路線與此相同。

1.3.1 含炔基MI 線性肽及含疊氮的賴氨酸多分支肽的合成 采用Fmoc-固相多肽合成法[10]，應(yīng)用自動(dòng)合成儀合成含炔基MI 線性肽MI-1、MI-2及含疊氮的賴氨酸多分支肽（D），序列如下：

然后將肽樹脂裂解（裂解液：TFA/DTT/H2O/TIPS=44/2.5/2.5/1，v/w/v/v），旋蒸除去大部分TFA后加入預(yù)冷的無水乙醚4℃沉淀，G4 漏斗過濾得到粗肽。

1.3.2 含炔基MI 線性肽的氧化折疊及純化 采用空氣氧化法折疊線性肽[11]。多肽折疊采用0.1 mol/L的NH4HCO3溶液（肽濃度為0.3 mg/mL），氨水調(diào)pH值至8.0，室溫?cái)嚢?4 h，用HPLC 監(jiān)測(cè)折疊產(chǎn)物。折疊完成后，用冰醋酸調(diào)pH 至5 終止折疊，反向高效液相色譜（RP-HPLC）法除鹽、富集。

采用高效液相色譜純化粗肽，純化柱為C18半制備柱（Kromasil，300 ?，10 mm×250 mm）。色譜條件：0～2 min 5%～10% B，2～30 min 10%～60%B（依多肽不同流動(dòng)相B 比例相應(yīng)變化），30～31 min 60%～95% B，流動(dòng)相A 為含0.1% TFA的去離子水，流動(dòng)相B 為含0.1% TFA的乙腈，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，流速3 mL/min。粗肽純化后凍干，做HPLC 分析及質(zhì)譜鑒定。

1.3.3 賴氨酸多分支肽的純化 同1.3.2。

1.3.4 含炔基MI與D的CuAAc 反應(yīng)（click 反應(yīng)）采用銅[Cu（I）]催化疊氮-炔雜環(huán)化反應(yīng)（Cu?AAc）[12-14]，將含炔基MI 連接至賴氨酸多分支肽，合成N、C端連接的MI 多分支抗原。

溶解含炔基肽（16 eq）至190 μL DMF 中，分別 加 入D（1 eq）、CuSO4（1.6 eq）、TBTA（1.6 eq）。通氮?dú)?5 min后，加入抗壞血酸鈉（4 eq），氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?0 h，0、20、40 h 取樣做HPLC 分析。產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC 法純化，分離柱為C8半制備柱（Kromasil，300，10 mm×250 mm）。

1.4 含炔基MI 腹腔注射毒性

KM 小鼠雌雄各半，隨機(jī)分為MI-1 20 μg/kg組、MI-2 20、40 μg/kg 組，每組10只。腹腔注射200 μL后，記錄小鼠死亡時(shí)間，小鼠死亡時(shí)間以x±s表示。

1.5 小鼠免疫

BALB/c 小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、N端連接的MI 八分支肽10、20 μg/只組、C端連接的MI 八分支肽10、20 μg/只組，每組10只。免疫前取陰性血清作為對(duì)照，共4 次免疫?；A(chǔ)免疫時(shí)，八分支肽與完全弗氏佐劑等體積混合，皮下注射加腹腔注射（注射體積200 μL）?；A(chǔ)免疫后每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行3 次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時(shí)八分支肽與不完全弗氏佐劑等體積混合，免疫劑量和方式同基礎(chǔ)免疫。

1.6 MI 八分支肽抗血清滴度測(cè)定

圖1 C端連接的MI 多分支肽抗原的合成路線圖

設(shè)生理鹽水組、空白組及待測(cè)血清組，為保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性及重復(fù)性設(shè)2個(gè)復(fù)孔。各組血清采用相應(yīng)的八分支肽作為包被抗原，包被量均為100 ng/孔，4℃包被過夜，PBST 洗4 次，5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST 洗4 次，加入不同稀釋度待測(cè)血清（一抗），孵育1 h，PBST 洗4 次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（二抗），孵育30 min，PBST 洗4 次，TMB 底物顯色15 min，再加0.5 mol/L 硫酸終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)D450nm及D600nm值。數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010 處理。D值為D450nm值減去D600nm值。最終以生理鹽水組的2.1倍為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 中和活性實(shí)驗(yàn)

KM 小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為6 組，即陰性對(duì)照組MI、生理鹽水組、N端連接的MI 八分支肽組（10、20 μg/只）、C端連接的MI 八分支肽組（10、20 μg/只），每組10只，各組血清與MI（20 μg/kg）混合，37℃孵育40 min后腹腔注射，記錄小鼠死亡時(shí)間。采用Log-rank 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法比較抗血清組與對(duì)照組的死亡時(shí)間差別。

2 結(jié)果

2.1 含炔基MI的合成

含炔基MI的線性肽、折疊產(chǎn)物及純肽的HPLC 分析見圖2。結(jié)果表明，MI-1、MI-2 線性肽折疊為一個(gè)主峰，純化后多肽純度均大于95%。質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果顯示，MI-1、MI-2的M+1 峰值為1587.55 及1831.65，與其理論單同位素分子量1586.64、1830.76 一致。

2.2 MI 多分支肽的合成結(jié)果

圖2 含炔基MI 線性肽、折疊產(chǎn)物及純肽的HPLC 分析圖

圖3 N端（A）及C端（B）連接的MI 多分支肽點(diǎn)擊反應(yīng)產(chǎn)物及純肽的HPLC 分析

含炔基MI與賴氨酸多分支肽的點(diǎn)擊反應(yīng)產(chǎn)物為一個(gè)主產(chǎn)物（圖3）及反應(yīng)原料，產(chǎn)物純化后，質(zhì)譜分析結(jié)果如圖4 所示，均為八分支肽。

圖4 MI 多分支肽的質(zhì)譜分析圖

2.3 含炔基MI 小鼠腹腔注射毒性

結(jié)果表明，N端連接炔基的MI（MI-1）的毒性有所降低，20 μg/kg MI-1 組的小鼠死亡率為50%，同樣劑量的MI的死亡率為100%。C端連接炔基的MI（MI-2）20、40 μg/kg 劑量組的小鼠死亡率分別為0 及20%，明顯低于MI。

表1 小鼠血清抗體滴度測(cè)定結(jié)果

2.4 MI 八分支抗原的抗體滴度

MI 八分支抗原4 次免疫后2周采集的血清抗體滴度結(jié)果見圖5 及表1。10、20 μg/只劑量的N端連接MI 八分支肽組第4 次免疫后血清抗體滴度分別為1∶400 及1∶6400，10、20 μg/只劑量的C端連接MI 八分支肽組第4 次免疫后血清抗體滴度分別為1∶3200 及1∶25 600。

2.5 抗血清的中和活性

各組血清與MI（20 μg/kg）的中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6 及表2。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠死亡率均為100%，GraphPad Prism 做生存曲線圖，Log-rank 檢驗(yàn)對(duì)各組進(jìn)行多重比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示小鼠死亡時(shí)間與對(duì)照組比較無顯著差異（P=0.5855）。

3 討論

賴氨酸分支肽連接多個(gè)精氨酸主要考慮增加目標(biāo)分支肽的溶解度及穿膜性?？紤]空間位阻對(duì)MI 多分支肽合成效率的影響，在MI的N端連接一個(gè)5-己炔酸、C端增加2個(gè)GG，結(jié)果表明MI-1 或MI-2的折疊效率仍很高，與賴氨酸多分支肽點(diǎn)擊反應(yīng)時(shí)效率較高。

圖5 小鼠血清抗體滴度測(cè)定結(jié)果

為使反應(yīng)完全，我們采用含炔基MI與賴氨酸多分支肽的反應(yīng)比例為16∶1，即含炔基MI與疊氮的摩爾比例為2∶1。為使抗壞血酸鈉能有效還原二價(jià)銅離子為一價(jià)銅離子并盡可能減少對(duì)毒素二硫鍵的還原，須控制抗壞血酸鈉的用量，一般采用抗壞血酸鈉與含炔基MI的摩爾比例為1∶4。實(shí)驗(yàn)采用氮?dú)獗Ｗo(hù)，以防一價(jià)銅離子被氧化而喪失催化活性[15-16]。

圖6 200 μL 血清與MI（20 μg/kg）中和結(jié)果

表2 200 μL血清與MI（20 μg/kg）中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）

免疫原性與其各自單體的毒性并無對(duì)應(yīng)關(guān)系，由C端含炔基連接的MI 毒性低于N端含炔基連接的MI，但N端連接的MI 八分支肽組免疫后的抗血清滴度明顯低于C端連接的MI 八分支肽組，且2個(gè)八分支肽的毒性較低，20 μg/只對(duì)小鼠無明顯毒性。

MI 八分支抗原的免疫原性較低，抗血清的抗毒活性不高，原因可能是MI 本身免疫抗原性低，這與其序列短、親水氨基酸多有關(guān)。