侯亞璐，井金苗，魏治靜，柳峰松，吳萌

1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定071002；2.河北省科學(xué)院，河北 石家莊050081

心力衰竭（心衰）是由于各種心臟結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致心臟收縮和（或）舒張功能受損的一組復(fù)雜綜合征。當(dāng)今我國老齡化嚴(yán)重，各種心臟疾病及心血管疾病不斷增加，導(dǎo)致心衰的發(fā)病率極高，因而對于心衰的診斷和防治迫在眉睫[1]。由各種原因引起的心衰和心臟功能障礙可導(dǎo)致腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）或人N端腦鈉肽前體（N-terminal pro-BNP，NT-proBNP）增加[2-4]。2014 版《中國心力衰竭診斷和治療指南》指出，BNP 或NT-proBNP 有助于預(yù)測心衰和術(shù)后動態(tài)監(jiān)測（Ⅰ類，A 級推薦）。目前國際上與心衰相關(guān)的蛋白標(biāo)志物應(yīng)用最多的主要是BNP和NTproBNP，在危險(xiǎn)分層方面體現(xiàn)得尤為突出[5]。相對于BNP，NT-proBNP的半衰期、體外穩(wěn)定時(shí)間更長，靈敏度更高，不受標(biāo)本采集條件的限制，更有利于心衰的診斷[6-8]。

目前，NT-proBNP的檢測主要是免疫學(xué)方法，應(yīng)用最廣泛的是NT-proBNP 快速檢測試劑盒，但所需抗體多為國外壟斷，進(jìn)口成本高，使得國內(nèi)NT-proBNP檢測產(chǎn)品價(jià)格居高。因此，研制特異性良好的抗NT-proBNP 單克隆抗體，對推動國內(nèi)檢測試劑的發(fā)展具有重要意義[9]。在此，我們采用2種方法預(yù)測NT-proBNP B細(xì)胞抗原表位，選出最合適的表位肽段，偶聯(lián)得到免疫原，制備了特異性針對NT-proBNP 抗原表位的單克隆抗體，為研發(fā)NT-proBNP 快速檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c 小鼠購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由河北省科學(xué)院生物研究所細(xì)胞生化研究室保存；多肽合成由吉爾生化有限公司完成；NT-proBNP 重組蛋白購自廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司。

HAT 培養(yǎng)基、HT 培養(yǎng)基、PEG4000、雙抗、吐溫20、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）、鼠源單抗亞型鑒定試劑盒為Sigma 公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM 為GIBCO 公司產(chǎn)品；HEPES為Amresco 公司產(chǎn)品；HRP 標(biāo)記羊抗小鼠IgG 購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（SANYO 公司）；倒置顯微鏡（Olympus 公司）；酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、-80℃冰箱（Thermo公司）；恒溫水浴箱（上海一恒科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Eppendorf 公司）。

1.2 NT-proBNP 抗原表位預(yù)測及免疫原獲得

調(diào)取NCBI 蛋白數(shù)據(jù)庫人NT-proBNP的氨基酸序列信息，通過Bepipred[10]線性表位預(yù)測方法預(yù)測人NT-proBNP B細(xì)胞抗原表位；同時(shí)，利用Epi?tope Prediction System 軟件（由河北省科學(xué)院生物研究所細(xì)胞生化研究室提供），以11個(gè)氨基酸殘基為一組，對其序列進(jìn)行包括主鏈活動性、親水性、電荷分布、可及性等多參數(shù)預(yù)測，選擇綜合抗原表位曲線窗口預(yù)測NT-proBNP 抗原表位[11]。綜合2種方法比較分析選出最優(yōu)表位肽結(jié)果，合成多肽，并偶聯(lián)載體蛋白KLH 作為免疫原；NTproBNP 重組蛋白用于抗體鑒定。

1.3 小鼠免疫方案

選6～8周齡雌性BALB/c 小鼠為試驗(yàn)動物，以上述得到的抗原為免疫原，按每只小鼠50 μg 免疫原的劑量免疫4～5 次，每次間隔2周，將免疫原用生理鹽水溶解并加入等量弗氏佐劑混合、乳化，在小鼠背部皮下多點(diǎn)注射。第1 次免疫采用弗氏完全佐劑，之后的免疫采用弗氏不完全佐劑。第4 次免疫7 d后，小鼠眼球采血進(jìn)行效價(jià)檢測，選取效價(jià)達(dá)到融合要求的小鼠于融合前3 d 尾靜脈加強(qiáng)免疫，抗原加強(qiáng)劑量為30 μg，不加佐劑[12-13]。

1.4 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選

融合前1～2周復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞，通過PEG 法將處于對數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞和加強(qiáng)免疫過的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，將融合后的細(xì)胞用HAT 培養(yǎng)基于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后換液，10 d 左右采用間接ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清，免疫小鼠血清為陽性對照，正常小鼠血清為陰性對照，稀釋液為空白對照。將陽性克隆孔通過有限稀釋法持續(xù)亞克隆，直至篩選出能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

1.5 腹水制備及單抗純化

將篩選的能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法大量制備單克隆抗體。提前1周向BALB/c 小鼠腹腔接種500 μL 液體石蠟油，之后將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞株注射到小鼠腹腔內(nèi)，待小鼠腹部腫大突出時(shí)采集腹水，離心后收集上清。用Protern G親和層析柱純化抗體。

1.6 單克隆抗體的鑒定

1.6.1 抗體純度鑒定 取10 μg 抗體與4×SDS 凝膠上樣緩沖液混勻，沸水煮10 min，上樣進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后鑒定抗體的條帶。

1.6.2 抗體特異性鑒定 采用Western 印跡鑒定抗NT-proBNP表位肽單克隆抗體與NT-proBNP 抗原結(jié)合的特異性。將NT-proBNP 重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，加入制備的單抗作為一抗，HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 作為二抗，加入顯色液，觀察結(jié)果。

1.6.3 純化后抗體效價(jià)測定 采用間接ELISA 法檢測純化后的抗體效價(jià)。將NT-proBNP 重組蛋白包被酶標(biāo)板條，4℃過夜或37℃孵育1 h；用含10%胎牛血清的封閉液封閉；將純化的抗NTproBNP 單克隆抗體和正常小鼠血清（作為陰性對照）進(jìn)行梯度稀釋，并設(shè)置空白對照，37℃孵育；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG；TMB 顯色液顯色；硫酸終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取D450nm值。除去空白對照后，待測孔與陰性對照的D450nm比值P/N≥2.1，則為陽性孔，最高稀釋率即為效價(jià)。

1.6.4 抗體亞型鑒定 采用Sigma 公司的鼠源單克隆抗體亞型試劑盒鑒定單克隆抗體的亞型。

1.6.5 抗體親和力常數(shù)測定 參考萬文徽[14]、Be?atty[15]等的方法，采用非競爭ELISA 法測定抗體親和力常數(shù)。將NT-proBNP 重組蛋白分別以1、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/mL的濃度包被酶標(biāo)板，篩選的單克隆抗體做系列稀釋，用間接ELISA 法測定。讀取的D450nm值對抗體濃度的對數(shù)值做圖，找出不同抗原濃度下的曲線上1/2 最大D450nm值對應(yīng)的抗體濃度，代入下式計(jì)算親和力常數(shù)Ka：

Ka=（n-1）/2（n[Ab']t-[Ab]t），n=[Ab]t/[Ab']t

式中，[Ab']t和[Ab]t分別為2個(gè)不同抗原包被濃度對應(yīng)的抗體濃度（mol/L）。

2 結(jié)果

2.1 NT-proBNP B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果

Bepipred在線預(yù)測結(jié)果顯示，NT-proBNP的抗原表位區(qū)域主要在His1～Glu19、Asn22～His23、Val33、Thr36～Ser53、Glu55～Arg62（圖1、表1）；用Epitope Prediction System 軟件多參數(shù)預(yù)測預(yù)測到2個(gè)表位區(qū)域Ser15～Gln25、Glu39～Gly49（圖2、表2）。綜合2種方法預(yù)測的結(jié)果，選取共有的表位區(qū)域并適當(dāng)延長成2 段序列，在N端連上半胱氨酸并命名為NT-proBNP-P1和在C端連上半胱氨酸并命名為NT-proBNP-P2，見表3。根據(jù)此序列合成多肽，并與載體蛋白KLH 偶聯(lián)，得到完全抗原，測定的濃度分別為2.275和4.118 mg/mL。

圖1 Bepipred 預(yù)測表位結(jié)果

表1 Bepipred預(yù)測表位序列結(jié)果

圖2 Epitope Prediction System 預(yù)測表位結(jié)果

2.2 重組蛋白NT-proBNP的鑒定

對購買的重組蛋白NT-proBNP 進(jìn)行SDSPAGE（圖3），可知抗原條帶相對分子質(zhì)量約為13×103，與理論大小一致，雜帶較少，純度良好，測定購買的重組蛋白NT-proBNP 濃度為1.85 mg/mL，可用于后期的免疫小鼠血清及抗體鑒定。

2.3 免疫小鼠血清效價(jià)檢測及單克隆抗體制備

間接ELISA 法檢測P1-KLH、P2-KLH 免疫的小鼠血清效價(jià)分別達(dá)12 800、6400。通過P1-KLH 完全抗原免疫獲得6株可分泌NT-proBNP 抗體的細(xì)胞株2D5、2C8、2E1、4B9、4D3、4H2；通過P2-KLH 完全抗原免疫獲得2株陽性雜交瘤細(xì)胞株1F9、5B5。對抗體進(jìn)行鑒定，從P2和P1表位肽獲得的抗體中選擇特異性最好的1F9和4H2 分別進(jìn)行特性分析。

表2 Epitope Prediction System預(yù)測表位序列結(jié)果

表3 合成肽序列

圖3 抗原SDS-PAGE 鑒定結(jié)果

2.4 單克隆抗體特性鑒定

2.4.1 效價(jià)測定 純化后的抗NT-proBNP 單抗1F9和4H2 效價(jià)分別達(dá)4×104和4×105（圖4）。

2.4.2 亞型鑒定 鑒定結(jié)果表明，這2種抗體的亞型均為IgG1（圖5）。

2.4.3 純度鑒定 將獲得的單抗進(jìn)行SDS-PAGE（圖6），均在相對分子質(zhì)量25×103與50×103附近出現(xiàn)明顯的條帶，即對應(yīng)IgG的輕鏈和重鏈，且純度良好。

2.4.4 特異性鑒定 Western 印跡顯示，1F9和4H2 能與NT-proBNP 重組蛋白在相對分子質(zhì)量約13×103處出現(xiàn)明顯的條帶，表明這2種單抗能與NT-proBNP 重組蛋白特異性結(jié)合（圖7）。

圖4 單克隆抗體的效價(jià)分析

2.4.5 親和力測定 通過Oringin9.0 軟件繪制相對親和力曲線，根據(jù)親和力計(jì)算公式，可得出1F9和4H2的相對親和力常數(shù)分別為1.14×107和1.6×107L /mol（圖8）。

圖5 單克隆抗體的亞型鑒定結(jié)果

圖6 純化后單克隆抗體的SDS-PAGE

圖7 單克隆抗體的Western 印跡

圖8 單克隆抗體的相對親和力曲線

3 討論

N端腦鈉肽前體檢測為心衰診斷和治療提供了重要的依據(jù)，大量的臨床應(yīng)用表明其是反應(yīng)心衰和心臟功能障礙的不錯(cuò)指標(biāo)[16]。而研制NTproBNP 定量檢測試劑盒必不可少需要特異性強(qiáng)且親和力高的抗體。

本研究通過Bepipred在線表位預(yù)測方法和Epitope Prediction System 軟件預(yù)測NT-proBNP B細(xì)胞抗原表位，綜合2種預(yù)測結(jié)果對比優(yōu)化選取合適的2個(gè)表位肽并合成，因多肽免疫原性低，難以引起小鼠的免疫反應(yīng)，偶聯(lián)KLH 得到完全抗原誘發(fā)小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答。以P1-KLH和P2-KLH為免疫原，采用背部皮下多點(diǎn)注射方法免疫BALB/c 小鼠，利用PEG 進(jìn)行細(xì)胞融合，采用間接ELISA 法和有限稀釋法亞克隆共篩選出8株能穩(wěn)定分泌抗NT-proBNP 單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株，選擇特異性最好的4H2和1F9 分別進(jìn)行了特性分析，表明二者具備良好的抗體特性，為NT-proBNP 定量檢測試劑盒的研制提供了抗體原料，但其臨床應(yīng)用效果還須進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。