鐘瑾怡， 成叢叢， 徐金媛， 李雪松， 張 升， 張寶剛， 王麗華， 史立宏， 4△

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院， 2附屬醫(yī)院分子腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 3病理學(xué)教研室， 4山東省應(yīng)用藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 濰坊 261053)

雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長因子受體均為陰性的三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌中最難治愈的類型，具有較高的復(fù)發(fā)率和死亡率[1]。目前化療仍是治療乳腺癌的主要方法，但是腫瘤細(xì)胞極易產(chǎn)生耐藥性往往導(dǎo)致乳腺癌預(yù)后不佳。對化療耐藥的腫瘤細(xì)胞同時(shí)具有腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)的特征，而乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells，BCSCs)是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生、復(fù)發(fā)、耐藥及轉(zhuǎn)移的根源。

據(jù)報(bào)道，CD44是一組廣泛分布的跨膜糖蛋白黏附因子，在腫瘤的成瘤、侵襲和轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和組織分期有緊密的聯(lián)系，是公認(rèn)的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物；同樣為干細(xì)胞標(biāo)志物的CD133，是一種單域糖蛋白，在結(jié)腸癌、肺癌和胃癌等許多腫瘤干細(xì)胞中均有表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，CD133與Oct-4在許多腫瘤中有密切關(guān)系[2]。Oct-4是誘導(dǎo)干細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，與維持腫瘤干細(xì)胞自我更新能力和分化潛能有關(guān)，可通過Stat3等通路發(fā)揮其生物學(xué)作用。Stat3的激活使非CSCs動(dòng)力學(xué)轉(zhuǎn)向CSCs[3-4]，可調(diào)節(jié)Oct-4和SOX2等下游基因以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的其它信號分子。黃傳錢等[5]發(fā)現(xiàn)，Oct-4和CD44可對腸癌干細(xì)胞特性具有一定的調(diào)控作用；但是有關(guān)Stat3-Oct-4/CD44通路在化療藥物誘發(fā)的乳腺癌細(xì)胞干性轉(zhuǎn)化中的作用尚未見報(bào)道。

因此，在這項(xiàng)研究中，我們選用具有高度致瘤性和侵襲性的小鼠三陰性乳腺癌細(xì)胞系4T1作為模型系統(tǒng)，探討了Stat3-Oct-4/CD44信號通路在多柔比星(doxorubicin, DOX)誘導(dǎo)的4T1細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞富集和發(fā)展中的作用與機(jī)制，從而為三陰性乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 試劑

將DOX(Sigma)溶解于10 mmol/L儲(chǔ)備液的無菌水中；WP1066(Selleckchem)在50 mmol/L和5 g/L儲(chǔ)備液的DMSO(Solarbio)中溶解；CD133和CD44抗體(Proteintech)；10%FBS、1%青霉素/鏈霉素、RIPA 裂解液和PMSF(Solarbio)；RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；聚偏二氟乙烯膜(Millipore)；PE-CD44抗體(BD Biosciences)。

2 細(xì)胞系和培養(yǎng)

小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞和人乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞購自ATCC,在含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3 方法

3.1成球分析 腫瘤成球?qū)嶒?yàn)在低黏附的培養(yǎng)皿(Corning)進(jìn)行。將細(xì)胞以每孔8 000個(gè)細(xì)胞的密度接種，培養(yǎng)液中加入B27(Gibco)、N-2(Gibco)、EGF(PeproTech)20 μg/L、IGF(PeproTech)20 μg/L、10 μg/L bFGF(PeproTech)和5 mg/L肝素(Solarbio)，培養(yǎng)7 d后，在400×的倒置顯微鏡下觀察。

3.2免疫熒光染色 分別將爬滿4T1-DOX和4T1細(xì)胞的蓋玻片固定在4%多聚甲醛10 min。用1×PBS緩沖液中洗滌3次，然后使用山羊血清封閉1 h。細(xì)胞與抗CD133抗體在4 ℃孵育過夜。在PBS中洗滌后，將細(xì)胞在37 ℃下在 II 抗中孵育1 h。用PBS洗滌細(xì)胞，用DAPI染色10 min，再洗滌3次，然后用封固介質(zhì)覆蓋。200倍視野下觀察免疫熒光染色并照相。

3.3Western blot分析 提取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞蛋白。細(xì)胞用RIPA 與PMSF混合液裂解，然后在4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。收集上清液，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。然后孵育 I 抗4 ℃、12 h，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗37 ℃下反應(yīng)1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑ECL發(fā)光并在暗室曝光膠片。

3.4流式細(xì)胞術(shù) 將4T1-DOX細(xì)胞和4T1細(xì)胞消化、PBS洗滌并以1010/L的濃度重懸于PBS中。將細(xì)胞懸浮液與PE-CD44抗體孵育30 min，并用PBS洗滌樣品。并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur)檢測；將同種型匹配的小鼠免疫球蛋白作為對照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用t檢驗(yàn)進(jìn)行評估。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 低濃度多柔比星誘導(dǎo)4T1細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性

4T1細(xì)胞分別與不同濃度(0、0.05、0.1和0.5 μmol/L)的多柔比星孵育24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果顯示，0.05 μmol/L多柔比星可使細(xì)胞體積略有增大; 而濃度為0.1 μmol/L時(shí)，4T1細(xì)胞體積顯著增大，且大部分細(xì)胞存活；當(dāng)濃度增加到0.5 μmol/L時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞都被破壞，觀察到許多壞死細(xì)胞，見圖1。因此，我們以0.1 μmol/L多柔比星為最適濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1.The cell morphological changes after continuous stimulation with different concentrations of doxorubicin (DOX; ×400).

圖1不同濃度的多柔比星持續(xù)刺激后4T1細(xì)胞的形態(tài)觀察

2 多柔比星誘導(dǎo)的4T1細(xì)胞表現(xiàn)出干細(xì)胞樣特征

我們通過成球?qū)嶒?yàn)來評估4T1-DOX細(xì)胞的成球能力，在多種細(xì)胞因子的作用下，4T1-DOX細(xì)胞形成球體的數(shù)量明顯增多，且體積較4T1細(xì)胞顯著增大；同時(shí)我們用人乳腺癌MDA-MB-468-DOX細(xì)胞進(jìn)行成球?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與4T1細(xì)胞相一致，MDA-MB-468-DOX細(xì)胞形成球體的體積較MDA-MB-468顯著增大，見圖2A。這一結(jié)果表明4T1細(xì)胞經(jīng)過多柔比星長期誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性后表現(xiàn)出干細(xì)胞樣特征。同時(shí)，我們檢測特異性CSCs標(biāo)志物CD44和CD133在4T1細(xì)胞和4T1-DOX細(xì)胞表面的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)分析檢測發(fā)現(xiàn)4T1-DOX細(xì)胞中CD44的表達(dá)遠(yuǎn)高于4T1細(xì)胞，見圖1B。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)4T1-DOX細(xì)胞中CD133的表達(dá)水平較4T1細(xì)胞顯著增高,見圖1C。4T1-DOX細(xì)胞中CD44和CD133的高表達(dá)進(jìn)一步表明連續(xù)的多柔比星刺激誘導(dǎo)了BCSCs在4T1細(xì)胞中的富集。

3 4T1-DOX細(xì)胞中p-Stat3與Oct-4的表達(dá)增加

為了研究Stat3是否參與多柔比星誘導(dǎo)的腫瘤干細(xì)胞富集，我們測試了Stat3的表達(dá)和活化。Wes-tern blot結(jié)果顯示，盡管4T1-DOX細(xì)胞與4T1細(xì)胞之間總Stat3表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，但是在4T1-DOX細(xì)胞中磷酸化的Stat3明顯升高(P<0.05)；同時(shí)多能轉(zhuǎn)錄因子Oct-4在4T1-DOX細(xì)胞中的表達(dá)較4T1細(xì)胞明顯增高(P<0.05),見圖3。這一結(jié)果提示多柔比星可能通過Stat3-Oct-4途徑參與了4T1細(xì)胞中多柔比星誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞形成的調(diào)控。

4 抑制Stat3的活化后Oct-4與CD44的表達(dá)降低

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，我們應(yīng)用Stat3活化的抑制劑WP1066來進(jìn)一步觀察Stat3在多柔比星誘導(dǎo)4T1細(xì)胞干性轉(zhuǎn)化中的作用，結(jié)果顯示，WP1066(1.25 μmol/L)能夠顯著抑制Stat3的磷酸化，p-Stat3蛋白水平明顯減少(P<0.05);隨著Stat3的激活被抑制，Oct-4在4T1-DOX細(xì)胞的表達(dá)量也相應(yīng)降低(P<0.05)，見圖4A。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，WP1066處理后，4T1-DOX細(xì)胞中的CD44+細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05),見圖4B；同時(shí)，成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果提示，WP1066抑制Stat3的活性后，4T1-DOX細(xì)胞的球體體積也隨之減小(P<0.05),見圖2A。這些結(jié)果表明抑制Stat3的活性后，干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達(dá)隨之發(fā)生下調(diào)，同時(shí)干性標(biāo)志分子CD44的表達(dá)也明顯下降，提示Stat3在多柔比星誘導(dǎo)的4T1細(xì)胞CSCs富集中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

討 論

Bonnet等[6]的工作最早確認(rèn)了腫瘤干細(xì)胞的存在，隨后腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及腫瘤的治療抵抗等方面的作用廣泛展開。腫瘤干細(xì)胞具有極強(qiáng)的增殖分化能力，對化療藥物具有較強(qiáng)的耐藥性，成為腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源，只有針對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行特定治療，才能從根本上治愈癌癥。因此，尋求高特異性的腫瘤干細(xì)胞的治療靶點(diǎn)從而設(shè)計(jì)高效的靶向藥物成為癌癥治愈的關(guān)鍵。

本研究表明低濃度的多柔比星(0.1 μmol/L)持續(xù)刺激誘導(dǎo)4T1-DOX細(xì)胞的體積增大，成球能力增強(qiáng)，提示三陰性乳腺癌細(xì)胞中具有腫瘤干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞；同時(shí)，干細(xì)胞標(biāo)志物CD44與CD133在4T1-DOX細(xì)胞中表達(dá)增高，進(jìn)一步證明了低濃度的多柔比星誘導(dǎo)促進(jìn)了4T1細(xì)胞中BCSCs的富集。Zhao等[7]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌預(yù)后不佳與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD133在細(xì)胞中呈高表達(dá)有關(guān)，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

Stat3是一類與酪氨酸磷酸化傳導(dǎo)途徑相關(guān)的功能性蛋白，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡與免疫逃逸中發(fā)揮重要作用；參與乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及血管的形成，是球囊形成和CSC過程的關(guān)鍵介質(zhì)。Lin等[8]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在鼻咽癌中沉默Stat3，可降低CD44的表達(dá)，由此可見CD44與Stat3呈正相關(guān)。Oct-4通過促進(jìn)CSCs自我更新在誘導(dǎo)CSCs中發(fā)揮重要作用，在許多實(shí)體瘤中都高表達(dá)[2]。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌干細(xì)胞中，Stat3過表達(dá)的細(xì)胞成球體積比敲除Stat3的球體體積增大；同時(shí)，Oct-4在Stat3過表達(dá)的細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在敲除Stat3的細(xì)胞中表達(dá)減少；表明Stat3可調(diào)控Oct-4影響宮頸癌干細(xì)胞的形成。有研究提示激活的Stat3在頭頸部鱗狀癌中的表達(dá)高于正常黏膜，同時(shí)CD44和Oct-4 的表達(dá)也增高，提示Stat3與CD44和Oct-4均呈正相關(guān)[10]；我們的結(jié)果也顯示4T1-DOX細(xì)胞中p-Stat3、Oct-4及CD44的表達(dá)量顯著提高，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，說明4T1-DOX細(xì)胞中Stat3的激活，使下游因子Oct-4和CD44的表達(dá)增加，細(xì)胞干性增強(qiáng)，促進(jìn)了BCSCs的富集。

Figure 2.Stem cell-like characteristics induced by doxorubicin (DOX) in the 4T1 cells. A: sphere formation test for 4T1 cells, 4T1-DOX cells, 4T1-DOX cells treated with WP1066, MDA-MB-468 cells, MDA-MB-468-DOX cells and MDA-MB-468-DOX cells treated with WP1066 (×400); B: flow cytometry analysis for CD44 expression in the 4T1 cells and 4T1-DOX cells; C: immunofluorescence staining showed increased expression of CD133 (red) in the 4T1-DOX cells, counterstained with DAPI (blue; ×200).

圖2多柔比星(0.1μmol/L)持續(xù)誘導(dǎo)下細(xì)胞成球能力及CD133和CD44的表達(dá)

Figure 3.Western blot analysis for determining the protein levels of Oct-4, p-Stat3 and Stat3 in the 4T1 cells and 4T1-DOX cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs4T1 group.

圖3Oct-4、p-Stat3和Stat3的蛋白水平在4T1細(xì)胞和4T1-DOX細(xì)胞的比較

Figure 4.WP1066 inhibited Stat3 activation and the protein levels of Oct-4, p-Stat3, Stat3 and CD44. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs4T1 group;##P<0.01 4T1-DOX group.

圖4WP1066抑制劑對Oct-4、p-Stat3、Stat3蛋白水平和CD44表達(dá)水平的影響

為了進(jìn)一步明確Stat3對Oct-4和CD44的調(diào)控作用，我們用Stat3的抑制劑WP1066抑制Stat3的活性，結(jié)果顯示W(wǎng)P1066顯著抑制了Stat3的磷酸化，4T1-DOX細(xì)胞在WP1066作用下Oct-4和CD44的表達(dá)量也明顯降低。這些結(jié)果說明多柔比星是通過Stat3-Oct-4/CD44途徑促進(jìn)了三陰性乳腺癌干性產(chǎn)生。

綜上所述，多柔比星誘導(dǎo)三陰性乳腺癌4T1細(xì)胞產(chǎn)生BCSCs富集，這是通過激活Stat3從而介導(dǎo)Oct-4、CD44和CD133的高表達(dá)進(jìn)而表現(xiàn)了干細(xì)胞的特征。這為我們針對Stat3-Oct-4通路設(shè)計(jì)三陰性乳腺癌的靶向治療藥物提供了理論依據(jù)。