王晨霄， 王夢(mèng)秋， 李 思， 馮 穎， 馬 芳， 吳衣論， 王 琳， 馬 學(xué)

(1四川大學(xué)華西醫(yī)院小兒泌尿外科， 2四川大學(xué)華西第二醫(yī)院出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 3四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院, 四川 成都 610041)

前列腺癌是一種發(fā)病隱匿、起病緩、對(duì)人體健康造成極大威脅的惡性腫瘤,居我國(guó)男性惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，雖然其發(fā)病率及死亡率尚不及一些西方國(guó)家，但近年來(lái)發(fā)病率和死亡率有逐漸上升的趨勢(shì)[1]。前列腺癌在我國(guó)的篩查和治療技術(shù)也尚未發(fā)展完善[2]。大多數(shù)前列腺癌生長(zhǎng)進(jìn)程緩慢，然而，有些腫瘤細(xì)胞可從前列腺擴(kuò)散到身體的其它部位，尤其是骨骼和淋巴結(jié)，對(duì)全身各系統(tǒng)都有不可逆轉(zhuǎn)的損傷。因此對(duì)于前列腺癌細(xì)胞凋亡和侵襲力的深入研究，有利于進(jìn)一步了解前列腺癌的致病機(jī)制。

唾液酸酶(sialidase;又稱神經(jīng)氨酸酶，neuraminidase，NEU)是一種可以通過(guò)水解α-糖苷鍵而切斷唾液酸與糖蛋白或糖脂上糖復(fù)合物連接的糖苷酶，廣泛分布在脊椎動(dòng)物和微生物中，包括病毒、細(xì)菌、真菌、支原體和原生動(dòng)物等[3]。近年來(lái)，唾液酸酶在人體中的作用愈發(fā)受到關(guān)注[1]。除了參與調(diào)節(jié)生理過(guò)程外，唾液酸酶還與很多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移以及凋亡過(guò)程[4]。研究顯示哺乳動(dòng)物體內(nèi)的唾液酸酶可被分為4種不同的類型，即神經(jīng)氨酸酶1(NEU1)、神經(jīng)氨酸酶2(NEU2)、神經(jīng)氨酸酶3(NEU3)和神經(jīng)氨酸酶4(NEU4)。不同類型的唾液酸酶在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布和功能不盡相同，它們?cè)趤喖?xì)胞定位、酶學(xué)性質(zhì)及染色體定位上有不同，并以組織特有的方式表達(dá)[5]。NEU3定位于細(xì)胞的漿膜上，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)分化。在結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞中，NEU3的表達(dá)明顯上調(diào)[6]，而這種異常增加與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)。已知的研究表明，在一些細(xì)胞中，NEU3可以增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，抑制細(xì)胞凋亡，其它3種唾液酸酶的作用則與之相反[4]。因此，NEU3可能是腫瘤起始、促進(jìn)和進(jìn)展一個(gè)顯著的決定因素，是治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。然而有關(guān)前列腺癌發(fā)生發(fā)展中，唾液酸酶，尤其是NEU3的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本文以人前列腺癌DU145細(xì)胞為研究對(duì)象，探討NEU3與人前列腺癌DU145細(xì)胞的活力、侵襲和凋亡的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)試劑

人前列腺癌細(xì)胞系DU145購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。DMEM、Opti-MEM和MEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(ScienCell)；胰蛋白酶(Invitrogen)；2-脫氧-2， 3-二脫氫-N-乙酰神經(jīng)氨酸(2-deoxy-2, 3-didehydro-N-acetylneuraminic acid，DANA; Santa Cruz Biotechnology)；siRNA(銳博生物)；Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)；TRIzol(Life Technologies)；CCK-8和凋亡檢測(cè)試劑盒(Dojindo)；抗NEU3兔單克隆抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)鼠單克隆抗體和抗凋亡抑制因子Bcl-2兔單克隆抗體(Zen BioScience)；HRP化學(xué)發(fā)光底物、Transwell小室和Matrigel(Millipore)；絲裂霉素(Sigma)；hBcl-2和hNEU3引物(成都擎科梓熙生物技術(shù)公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 DU145細(xì)胞在含10% 胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱恒溫37 ℃，含5% CO2，飽和濕度。每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，1～2 d換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至6孔板80%(1.5×105個(gè))左右傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分為空白對(duì)照(blank)組、DANA組和siRNA組,空白對(duì)照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，DANA組用含1 mmol/L DANA的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h， siRNA組加入NEU3 siRNA轉(zhuǎn)染處理。

2.2RNA干擾靶向沉默NEU3 配制siRNA組培養(yǎng)基：siRNA組培養(yǎng)基每100 μL含siRNA(50 nmol/L) 0.25 μL、Buffer(v2)6 μL、Lipofectamine 3000 0.3 μL、Opti-MEM 5.95 μL和MEM培養(yǎng)基87.5 μL。前后搖動(dòng)細(xì)胞板混合均勻，37 ℃孵育24 h。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 各組細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，加藥處理48 h后，每孔加CCK-8 10 μL，37 ℃避光孵育1～4 h。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值，其中每個(gè)樣品設(shè)3復(fù)孔。根據(jù)公式繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出各組細(xì)胞的活力。

2.4Western blot法檢測(cè)NEU3、MMP2和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平 BCA法測(cè)蛋白濃度，將蛋白樣本與5×Loading Buffer以4∶1的比例配制上樣終液，95 ℃變性5 min，配膠(10%分離膠，5%濃縮膠)后進(jìn)行SDS-PAGE分離(80～100 V，2 h)，恒壓(70 V，30 min)轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜夾至封閉液(5%脫脂牛奶)中，室溫封閉1 h。加入 I 抗，4 ℃搖床過(guò)夜。回收 I 抗，然后TBST搖動(dòng)洗膜4次，每次10 min。然后在低速搖床上進(jìn)行 II 抗孵育1 h，TBST搖動(dòng)洗膜4次，每次10 min。發(fā)光底物按1∶1的比例配制，加入有膜的孵育盒，吹打1 min后，轉(zhuǎn)移到濕潤(rùn)保鮮膜上。用膠帶粘于暗盒中進(jìn)行曝光。Western blot結(jié)果應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

2.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 Transwell小室放入24孔板中，在小室內(nèi)鋪上用PBS 1∶8稀釋的Matrigel(50 mg/L)，細(xì)胞用絲裂霉素處理30 min后消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù),鋪板于小室內(nèi),每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞,小室內(nèi)無(wú)血清培養(yǎng)基，24孔板為30%血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育48 h(干擾表達(dá)實(shí)驗(yàn))或24 h(過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn))后，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗數(shù)次，結(jié)晶紫染色5 min，PBS清洗后，使用Nickon EclipseTi-U顯微鏡拍照。

2.6qPCR法檢測(cè)2種處理方式對(duì)凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平的影響 參照TRIzol說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，隨后DNA酶處理去除DNA的影響。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。程序?yàn)椋?37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 保存。合成引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，hNEU3的上游引物序列為5’-AATGTGAAGTGGCAGAGGTGA-3’，下游引物序列為5’-TCACAGAGCTGTCGACTCAGG-3’；hBcl-2的上游引物序列為5’-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3’，下游引物序列為5’-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3’;hGAPDH的上游引物序列為5’-AACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’,下游引物序列為5’-GCCAGTAGAGGCAGGGATGA-3’。用cDNA作為模板，采用SYBR染料熒光標(biāo)記，Life 7500定量PCR儀檢測(cè)。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2種處理方式對(duì)細(xì)胞凋亡水平的影響 用PBS洗細(xì)胞2次，胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清。加入PBS后1 000 r/min離心3 min，重復(fù)1次后加入1×Annexin V Binding Solution，制成終濃度為1×109/L的細(xì)胞懸液。在EP管中加入細(xì)胞懸液5 μL和Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI Solution。室溫下避光培養(yǎng)15 min，加入500 μL 1×Annexin V Binding Solution，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用Prism 6 制圖和進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DANA處理和NEU3沉默后對(duì)人前列腺癌DU145細(xì)胞NEU3表達(dá)的影響

DANA處理和轉(zhuǎn)染NEU3 siRNA后，用Western blot法檢測(cè)DU145細(xì)胞中NEU3蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，DANA處理前后NEU3蛋白水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而siRNA轉(zhuǎn)染后，NEU3蛋白的表達(dá)量明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖1。因?yàn)镈ANA是在胞外結(jié)合蛋白達(dá)到抑制效果，不會(huì)減少蛋白數(shù)量，而siRNA的原理是干擾蛋白表達(dá)，故此結(jié)果可說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染效果較好。

Figure 1.The effects of DANA andNEU3 silencing on the protein level of NEU3 in the prostate cancer DU145 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖1DANA和NEU3沉默對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞NEU3蛋白水平的影響

2 DANA處理和NEU3沉默對(duì)DU145細(xì)胞活力的影響

采取CCK-8法分別觀察DANA處理和NEU3沉默處理后DU145細(xì)胞活力的變化，結(jié)果顯示DANA處理與NEU3沉默后細(xì)胞活力均增加，且沉默后細(xì)胞活力的增加趨勢(shì)更加顯著，兩處理組與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effects of DANA andNEU3 silencing on the viability of prostate cancer DU145 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank group.

圖2DANA和NEU3沉默對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞活力的影響

3 DANA處理和NEU3沉默對(duì)DU145細(xì)胞MMP2表達(dá)的影響

根據(jù)Western blot結(jié)果，與空白對(duì)照組相比，DANA處理后DU145細(xì)胞的MMP2表達(dá)下降(P<0.05)，NEU3 siRNA處理對(duì)MMP2蛋白表達(dá)的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The effects of DANA andNEU3 silencing on the protein level of MMP2 in the prostate cancer DU145 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3DANA和NEU3沉默對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞MMP2蛋白水平的影響

4 DANA處理和NEU3沉默對(duì)DU145細(xì)胞侵襲能力的影響

用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DU145細(xì)胞的侵襲能力，與空白對(duì)照組相比，用DANA處理后的DU145細(xì)胞侵襲力明顯降低(P<0.01)；NEU3 siRNA處理后細(xì)胞侵襲力稍有降低，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說(shuō)明抑制NEU3活性可以抑制細(xì)胞侵襲，而抑制NEU3表達(dá)則對(duì)細(xì)胞的侵襲無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The effects of DANA andNEU3 silencing on the invasion ability of prostate cancer DU145 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖4檢測(cè)DANA和NEU3沉默對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞侵襲能力的影響

5 DANA處理和NEU3沉默對(duì)DU145細(xì)胞凋亡能力的影響

Annexin V-FITC/PI雙染標(biāo)記后采取流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的前列腺癌細(xì)胞凋亡水平,DANA處理后細(xì)胞的凋亡水平無(wú)明顯變化，而經(jīng)過(guò)siRNA處理后細(xì)胞凋亡比例明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The effects of DANA andNEU3 silencing on the apoptosis of prostate cancer DU145 cells analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖5DANA和NEU3沉默對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡水平的影響

6 DANA處理和NEU3沉默對(duì)DU145細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白水平的影響

應(yīng)用qPCR方法檢測(cè)Bcl-2的mRNA水平,DANA處理和RNA干擾后Bcl-2 的mRNA水平均有下降趨勢(shì)，且DANA處理組更顯著(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比，DANA處理后DU145細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)受到明顯抑制,NEU3 siRNA處理對(duì)Bcl-2蛋白的表達(dá)有下調(diào)作用(P<0.05)，與qPCR結(jié)果一致，見(jiàn)圖6。

討 論

Figure 6.The effects of DANA andNEU3 silencing on the expression of Bcl-2 at mRNA and protein levels in the prostate cancer DU145 cells. A: the mRNA expression of Bcl-2 was detected by qPCR; B: the protein expression of Bcl-2 was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖6DANA和NEU3沉默對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞Bcl-2mRNA和蛋白水平的影響

作為一種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病，腫瘤的確切病因及致病過(guò)程還不甚明朗。目前針對(duì)腫瘤致病機(jī)理的研究多集中在基因水平，癌基因的激活或者抑癌基因的失活以及其它相關(guān)調(diào)節(jié)基因的突變等均是目前研究的焦點(diǎn)[7]。隨著人們對(duì)生命科學(xué)的認(rèn)識(shí)不斷深入，糖與人體各種生理和病理過(guò)程，特別是腫瘤的相關(guān)性越來(lái)越受到關(guān)注。有關(guān)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的研究顯示，NEU3可通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)直接作用于細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路，并且在Akt途徑上對(duì)EGFR起作用[8]；在患頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的患者體內(nèi)，腫瘤組織中的NEU3含量相較正常組織中明顯上調(diào)，并且MMP9表達(dá)增高，提示NEU3提高了頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的活性與侵襲力[9]; NEU3作為神經(jīng)節(jié)苷脂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路，與結(jié)腸癌的癌變過(guò)程有關(guān)。研究顯示，NEU3在受體水平調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路，可能在結(jié)腸癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的維持過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)Ras/絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)通路的信號(hào)調(diào)節(jié)可能與腫瘤侵襲水平相關(guān)[10];關(guān)于HeLa細(xì)胞外泌體(exosome)的研究顯示，NEU3通過(guò)調(diào)節(jié)負(fù)電荷和改變糖蛋白的位阻，提高HeLa細(xì)胞exosome的動(dòng)力生物學(xué)特性，因此，exosome表面的NEU3有望成為exosome的檢驗(yàn)標(biāo)志物之一，并且作為細(xì)胞間信息與物質(zhì)傳遞的重要載體，exosome在生理、病理過(guò)程中發(fā)揮的作用尚不明確，NEU3可以成為進(jìn)一步研究exosome的有力工具[11]。

腫瘤之所以對(duì)人體有著極大的威脅，與其侵襲能力強(qiáng)及凋亡受抑制等特性有著密不可分的關(guān)系，故本次實(shí)驗(yàn)將焦點(diǎn)放在NEU3對(duì)前列腺癌細(xì)胞活力、侵襲及凋亡等生物學(xué)行為的影響上。從目前關(guān)于NEU3與腫瘤細(xì)胞的研究看來(lái)，不同部位、不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞似乎對(duì)NEU3的反應(yīng)不盡相同。本次實(shí)驗(yàn)采用DANA處理和siRNA沉默NEU3，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，Transwell方法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，qPCR方法檢測(cè)Bcl-2的mRNA水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2和MMP2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示siRNA組細(xì)胞活力增強(qiáng)，Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)均減少，而侵襲能力和MMP2水平無(wú)變化。根據(jù)結(jié)果推測(cè)，NEU3可以減弱前列腺癌細(xì)胞的活力，抑制凋亡能力，而對(duì)侵襲能力沒(méi)有明顯的影響，這與基于其它腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全相同，原因可能與實(shí)驗(yàn)選取的細(xì)胞株特性有關(guān)，也可能與NEU1、NEU2、NEU3和NEU4 4種唾液酸酶的相互作用有關(guān)。DANA可以同時(shí)抑制4種唾液酸酶的酶活性[12]，通過(guò)與DANA處理后的結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，抑制唾液酸酶活性可以抑制DU145細(xì)胞的侵襲力，這說(shuō)明唾液酸酶在腫瘤的侵襲過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，但其中主導(dǎo)的不是NEU3。其它3種唾液酸酶與腫瘤侵襲能力的關(guān)系仍需進(jìn)一步探索。對(duì)于細(xì)胞活力，單獨(dú)抑制NEU3和抑制總的唾液酸酶活性趨勢(shì)一致，說(shuō)明NEU3在影響前列腺癌活力的過(guò)程中，可能在4種唾液酸酶中起主要作用。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果，NEU3沉默后前列腺癌細(xì)胞的凋亡水平上升，而同時(shí)抑制4種唾液酸酶的活性時(shí)無(wú)明顯變化，顯示NEU3在細(xì)胞的凋亡過(guò)程中起抑制作用，而NEU1、NEU2和NEU4的整體效果與NEU3相反，因此4種唾液酸酶同時(shí)作用時(shí)對(duì)凋亡的影響不明顯。而后，我們針對(duì)凋亡通路進(jìn)行了初步探究，腫瘤細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)在DANA和NEU3沉默后均明顯下降，這與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果不完全相符。造成此結(jié)果的原因可能是外源性細(xì)胞凋亡途徑或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑等不同通路的相互作用，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步進(jìn)行探究。

哺乳動(dòng)物的唾液酸酶在各種細(xì)胞功能中的作用在很大程度上仍未被探索，部分原因是相對(duì)于其它蛋白質(zhì)的低表達(dá)水平和內(nèi)源性唾液酸酶的不穩(wěn)定性[13]，例如，除了最高度表達(dá)的NEU1形式外[14]，甚至所有的生理亞細(xì)胞定位都尚不清楚。雖然通過(guò)cDNA的轉(zhuǎn)染研究提供了亞細(xì)胞位點(diǎn)的證據(jù)，但重組蛋白的過(guò)度表達(dá)通常會(huì)導(dǎo)致人工干預(yù)的失敗。因此，進(jìn)一步明確唾液酸酶的性質(zhì)與功能，闡明其與腫瘤的關(guān)系，具有繼續(xù)探究的必要性與可行性。