馬海明， 強 玲， 劉曉康， 張寶軒△

[1廣饒縣人民醫(yī)院腫瘤科， 山東 東營 257300； 2山東省腫瘤防治研究院乳腺淋巴瘤科(內(nèi)十科)， 山東 濟南 250117]

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)具有廣泛的抗腫瘤作用，而對于其在腫瘤生物學(xué)中的作用仍然存在爭議。TNF-α是目前常用的腫瘤生物治療因子，其參與生物機體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等過程[1]。研究報道顯示，TNF-α可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞的凋亡，促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[2-3]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)能夠調(diào)控細胞的DNA重組、細胞自噬和炎性損傷等，并且與腫瘤細胞的多種生物學(xué)特性有關(guān)，下調(diào)HMGB1表達可以減弱乳腺癌MCF-7細胞的侵襲和遷移能力，并誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡，下調(diào)HMGB1在乳腺癌中發(fā)揮抑制作用[4-5]。本研究擬通過體外細胞實驗，以乳腺癌細胞MDA-MB-231為對象，用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)敲減乳腺癌細胞中HMGB1的表達，探討HMGB1對TNF-α誘導(dǎo)的乳腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響，為明確HMGB1在免疫微環(huán)境中對乳腺癌的作用提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要材料

HMGB1 siRNA和陰性對照siRNA(siRNA negative control, siRNA-NC)購自Abbexa；熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；TNF-α購自Peprotech；胰蛋白酶購自Amresco；兔抗Bax抗體和兔抗HMGB1抗體購自Saierbio；兔抗上皮鈣黏素(E-cadherin)抗體購自Novus Biologicals；兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloprotease 2，MMP-2)抗體、兔抗神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)抗體、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotease 9，MMP-9)抗體和HRP標記的II抗購自Santa Cruz；GAPDH引物和HMGB1引物為南京金斯瑞合成；細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶。

2 方法

2.1細胞分組處理 乳腺癌MDA-MB-231細胞(購自ATCC，用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶傳代)分為對照(control)組、TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組、HMGB1 siRNA+TNF-α組、siRNA-NC組和HMGB1 siRNA組，其中TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組和HMGB1 siRNA+TNF-α組的細胞于實驗開始時在培養(yǎng)液中添加15 μg/L的TNF-α；HMGB1 siRNA+TNF-α組和HMGB1 siRNA組為轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后的MDA-MB-231細胞； siRNA-NC+TNF-α組和siRNA-NC組為轉(zhuǎn)染siRNA-NC后的MDA-MB-231細胞；control組和TNF-α組為不做轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細胞；control組細胞的培養(yǎng)液中不添加TNF-α。MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。

2.2實時熒光定量PCR測定HMGB1的mRNA水平 Control組、siRNA-NC組和HMGB1 siRNA組細胞培養(yǎng)24 h以后收集細胞，用細胞總RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA。用分光光度計測定各組樣品中的RNA的濃度。以GAPDH為內(nèi)參照，按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書，首先合成cDNA的第一鏈，然后以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR程序為：95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s、 60 ℃ 60 s, 40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算各組樣品中的HMGB1水平。HMGB1的上游引物序列為5’-GCGAAGAAACTGGGAGAGATGTG-3’，下游引物序列為5’-GCATCAGGTTTCCTTTAGCTCG-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-TCATTGACCTCAACTACATGGTTT-3’，下游引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

2.3Western blot測定HMGB1蛋白水平 Control組、siRNA-NC組和HMGB1 siRNA組細胞培養(yǎng)24 h后，加入含PMSF的蛋白裂解液，在冰上放置5 min，使蛋白充分裂解;用細胞刮刀收集細胞，轉(zhuǎn)移到離心管中，放在4 ℃的低溫離心機中，14 000 ×g離心20 min。用BCA法對各組蛋白樣品進行定量檢測。用10%的分離膠進行蛋白電泳，電泳前按照每個泳道中添加40 μg的樣品將各組蛋白樣品煮沸變性，在濃縮膠中以80 V的電壓電泳，當?shù)鞍走M入到分離膠以后，用120 V的電壓繼續(xù)電泳至結(jié)束。100 V的條件下，在冰上將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉，與1∶800稀釋后的 I 抗反應(yīng)以后，與1∶3 000稀釋的 II抗結(jié)合，以ECL發(fā)光，用Quantity One對各自蛋白條帶定量分析(GAPDH為內(nèi)參照)。

2.4流式細胞術(shù)測定細胞凋亡 Control組、TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組和HMGB1 siRNA+TNF-α組細胞按照上述方法處理培養(yǎng)24 h后，PBS洗細胞2次，用胰蛋白酶消化各組細胞后，收集細胞沉淀，加入結(jié)合緩沖液重懸細胞，再依次添加Annexin V-FITC和PI后，把各組細胞放在避光條件下結(jié)合15 min以后，在1 h內(nèi)上機檢測。

2.5Transwell小室法測定細胞的侵襲能力 Control組、TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組和HMGB1 siRNA+TNF-α組細胞按照上述方法處理，用不含血清的培養(yǎng)液把細胞濃度都調(diào)整為1×108/L，分別吸取500 μL的各組細胞懸浮液加入基質(zhì)膠濕化以后的Transwell小室的上室，并且在其下室中添加600 μL含有血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，乙醇固定、HE染色以后，在400倍的顯微鏡下隨機選5個視野對侵襲細胞進行計數(shù)。

2.6細胞劃痕實驗測定遷移能力 Control組、TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組和HMGB1 siRNA+TNF-α組細胞融合度超過90%以后，按照2.5方法處理，在長滿的細胞底上畫一條細痕，并用PBS洗滌2次。添加新鮮的細胞培養(yǎng)液，24 h后，用Image-Pro Plus測定劃痕的距離，結(jié)果取平均值。以遷移的距離占劃痕初始寬度的百分比表示遷移率。

2.7Western blot測定E-cadherin、MMP-2、N-cadhe-rin、MMP-9和Bax的蛋白水平 Control組、TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組和HMGB1 siRNA+TNF-α組細胞按照上述方法處理培養(yǎng)24 h后，用Western blot方法測定E-cadherin、MMP-2、N-cadherin、MMP-9和Bax蛋白水平,方法同2.3。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間差異的比較用單因素方差分析，多重比較均采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后細胞中HMGB1的表達

轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后，MDA-MB-231細胞中HMGB1的mRNA和蛋白水平均明顯下降(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染siRNA-NC對乳腺癌細胞中HMGB1的mRNA和蛋白水平?jīng)]有影響，見圖1。

Figure 1.The expression of HMGB1 at mRNA (A) and protein (B) levels in transfected breast cancer cells determined by RT-qPCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC group.

圖1RT-qPCR和Westernblot測定轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細胞中HMGB1的表達水平

2 敲低HMGB1表達增加TNF-α對乳腺癌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用

MDA-MB-231細胞經(jīng)過TNF-α作用以后，與對照組相比凋亡率明顯升高(P<0.05)，說明TNF-α可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡；轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后經(jīng)TNF-α處理，細胞凋亡率更高(P<0.05)，敲減HMGB1表達和TNF-α刺激可以共同誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡，見圖2。

3 敲減HMGB1表達減弱TNF-α對乳腺癌細胞侵襲的誘導(dǎo)作用

MDA-MB-231細胞經(jīng)TNF-α處理后侵襲細胞的數(shù)目較對照組明顯增多(P<0.05)，說明TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌細胞侵襲；轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的侵襲細胞數(shù)目減少(P<0.05)，說明HMGB1 siRNA可以減弱TNF-α誘導(dǎo)的乳腺癌細胞的侵襲能力,見圖3。

Figure 2.The apoptosis rate in each group analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

圖2流式細胞術(shù)測定各組細胞的凋亡水平

Figure 3.Transwell chamber determination of the invasion ability of breast cancer cells in each group (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

圖3Transwell小室測定各組乳腺癌細胞的侵襲能力

4 敲減HMGB1表達減弱TNF-α對乳腺癌細胞遷移的誘導(dǎo)作用

MDA-MB-231細胞經(jīng)TNF-α處理后的遷移率明顯升高(P<0.05)，說明TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌細胞遷移；轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的細胞遷移率降低(P<0.05)，說明HMGB1 siRNA可以降低TNF-α誘導(dǎo)的乳腺癌細胞的遷移能力，見圖4。

5 敲減HMGB1表達減弱TNF-α對乳腺癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的誘導(dǎo)作用

經(jīng)TNF-α處理后MDA-MB-231細胞中的上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達下調(diào)，而間充質(zhì)細胞標志蛋白N-cadherin表達升高(P<0.05)，提示TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌細胞EMT;轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的細胞中上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達升高，而間充質(zhì)細胞標志蛋白N-cadherin表達降低(P<0.05)，說明HMGB1 siRNA可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的乳腺癌細胞EMT，見圖5。

6 敲減HMGB1表達對TNF-α作用的乳腺癌細胞MMP-2、MMP-9和Bax蛋白表達的影響

MDA-MB-231細胞經(jīng)TNF-α處理后MMP-2、MMP-9和Bax蛋白的表達水平升高(P<0.05);轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后經(jīng)TNF-α處理細胞中的MMP-2和MMP-9蛋白表達水平降低，而Bax蛋白表達水平升高(P<0.05)，說明HMGB1 siRNA對TNF-α處理后的乳腺癌細胞的作用與MMP-2、MMP-9和Bax蛋白表達有關(guān)，見圖6。

Figure 4.The migration ability of breast cancer MDA-MB-231 cells in each group detected by cell scratch test (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

圖4細胞劃痕實驗測定各組乳腺癌細胞的遷移能力

Figure 5.The expression of EMT marker proteins E-cadherin and N-cadherin in breast cancer MDA-MB-231 cells of each group determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

圖5Westernblot測定各組乳腺癌細胞中EMT標志蛋白E-cadherin和N-cadherin的表達

Figure 6.The protein expression of MMP-2, MMP-9 and Bax in the breast cancer MDA-MB-231 cells of each group determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

圖6Westernblot測定各組乳腺癌細胞中MMP-2、MMP-9和Bax的蛋白水平

討 論

TNF-α是一種主要由免疫細胞分泌的抗腫瘤因子，其屬于跨膜蛋白，在腸炎、關(guān)節(jié)炎和牛皮癬等自身免疫疾病中具有關(guān)鍵作用[6-7]。腫瘤小鼠模型經(jīng)過脂多糖或微生物等處理后，TNF-α是主要的免疫反應(yīng)因子，其可以引起炎癥[8-9]。腫瘤的發(fā)生過程中，混亂的基因表達和轉(zhuǎn)錄引起腫瘤細胞對TNF-α的敏感度增加，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡增多[10-12]。在多種體外實驗中發(fā)現(xiàn)，外源性的TNF-α可以促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，而在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)自身接種TNF-α可以減少黑色素瘤小鼠模型的腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。李曉敏等[14]的研究報道顯示，給予乳腺癌細胞外源性的TNF-α刺激以后，Transwell小室實驗中的乳腺癌細胞穿膜數(shù)目增加。侯娟[15]在探討TNF-α對乳腺癌化療敏感性的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞的凋亡，增加其化療敏感性。本實驗結(jié)果表明，TNF-α可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞MDA-MB-231的凋亡，促進乳腺癌細胞的侵襲和遷移，這與上述實驗報道相符。

HMGB1含有一個可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄的C端和2個可以與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，其能夠與Toll樣受體結(jié)合，調(diào)控多種炎癥因子的釋放[16]。在細胞受到外界環(huán)境的作用后，HMGB1可以促進TNF-α和內(nèi)毒素等的釋放，介導(dǎo)炎性損傷[17]。在肝癌和乳腺癌等多種腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HMGB1過度表達，并且可以調(diào)控腫瘤細胞的凋亡、侵襲和遷移過程，影響腫瘤細胞釋放免疫因子[18-20]。Ni 等[4]通過細胞轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的HMGB1 siRNA構(gòu)建下調(diào)HMGB1的乳腺癌MCF-7細胞，通過檢測HMGB1表達及細胞增殖、凋亡和遷移水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1沉默抑制人乳腺癌細胞的侵襲和遷移，促進細胞凋亡，提示HMGB1沉默可能是一種潛在的治療靶點。本實驗表明，HMGB1敲低后的乳腺癌細胞經(jīng)過TNF-α誘導(dǎo)以后，細胞的凋亡水平進一步增加，而細胞的侵襲和遷移能力下降，這說明HMGB1敲低可以與TNF-α共同發(fā)揮抗腫瘤的作用，綜合上述實驗報道，下調(diào)HMGB1不僅具有抗乳腺癌作用，還能夠與TNF-α協(xié)同共同抑制乳腺癌發(fā)生。

腫瘤細胞的侵襲、遷移和凋亡等多種生物學(xué)特性都受到細胞內(nèi)多種蛋白的嚴格調(diào)控。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，其在腫瘤組織中表達下調(diào)，而促進其表達后可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡[21-24]。在腫瘤的轉(zhuǎn)移中，腫瘤細胞能夠降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶，為腫瘤細胞突破組織屏障提供條件，MMP-2和MMP-9是目前研究發(fā)現(xiàn)的能夠降解細胞外基質(zhì)的主要蛋白酶，在多種腫瘤組織中表達升高[25-27]。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞的上皮細胞特性逐漸消失，而間充質(zhì)細胞特性逐漸增加，這成為腫瘤細胞的EMT，E-cadherin是上皮細胞的標志性蛋白，而N-cadherin是間充質(zhì)細胞的標志蛋白，E-cadherin在腫瘤組織中表達下調(diào)，而N-cadherin在腫瘤組織中表達升高[28-30]。本實驗結(jié)果顯示，TNF-α處理后的乳腺癌細胞中E-cadherin表達水平下降，N-cadherin表達水平升高，TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌細胞EMT，并且細胞中的Bax表達升高，MMP-2和MMP-9水平也升高，而下調(diào)HMGB1可以抑制TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌細胞EMT，降低細胞中MMP-2和MMP-9水平，促進Bax的表達，這提示下調(diào)HMGB1可以通過調(diào)控細胞EMT及Bax、MMP-2和MMP-9蛋白表達影響TNF-α對乳腺癌細胞的凋亡、侵襲和遷移的影響。