馬金珠， 顏 亮， 昝嘉偉， 徐 蕾, 王 毅， 張根葆△

(1安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心， 2安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 蕪湖 241002； 3南京大學(xué)化工學(xué)院， 江蘇 南京 210023)

非小細(xì)胞肺癌占肺癌總發(fā)病率的85%，因其預(yù)后差[1]和死亡率高占據(jù)腫瘤死亡率的第二位[2]，僅次于肝癌。非小細(xì)胞癌的病理機(jī)制極為復(fù)雜，目前還缺乏有效的靶位藥對(duì)其進(jìn)行有效治療，5年存活率低于15%[3]。因此，對(duì)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究，并開(kāi)發(fā)出新的靶向治療藥物對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的治療至關(guān)重要。

化學(xué)合成藥物是進(jìn)行藥物創(chuàng)新的重要方式之一。該方法先通過(guò)對(duì)先導(dǎo)物結(jié)構(gòu)所提供的信息進(jìn)行合成，再對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化或合成相關(guān)類似物，因而可能發(fā)現(xiàn)新的低毒性有效的藥物候選物[4]。在過(guò)去的幾年中，螺旋吲哚類衍生物以構(gòu)造一個(gè)手性季碳中心的合成方法取得了重要的進(jìn)展，如通過(guò)不對(duì)稱的分子內(nèi)赫克反應(yīng)，高選擇性地合成了螺-吡咯-3, 3′-吲哚衍生物[5]。 此外，通過(guò)吲哚與氨基酸脂和靛紅的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6]也可以高效得到螺旋吲哚衍生物。到目前為止，多數(shù)研究主要集中在螺旋吲哚類衍生物在合成方法及效率等方面，而對(duì)于螺旋吲哚衍生物的生物學(xué)活性尤其是抗腫瘤活性的研究還很少。 鑒于對(duì)螺旋吲哚衍生物在抗腫瘤藥物的篩選領(lǐng)域研究的重要性，本研究觀察了新合成的吡咯烷螺二吲哚(proline-spirooxindole，PSx)對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響，初步探討螺旋吲哚類衍生物的潛在抗腫瘤活性。

材 料 和 方 法

1 材料

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)。吡咯烷螺二吲哚為南京大學(xué)化工學(xué)院合成，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1A；胎牛血清購(gòu)自Gibco；CCK-8試劑盒購(gòu)自凱基生物科技公司；Anne-xin V/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD；DAPI染料購(gòu)自廣州銳博生物科技公司；鼠源抗p53、多ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]和mTOR抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗GAPDH抗體和兔抗鼠 II 抗購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549用含10%胎牛血清和抗生素(1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素)的DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%的CO2的環(huán)境下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2Western blot檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)蛋白 經(jīng)藥物處理24 h后，收集各組細(xì)胞裂解物。4 ℃、12 000×g離心5 min，取上清。BCA法測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，冷卻后，按照定量濃度，每孔上樣量為40 μg進(jìn)行上樣。經(jīng)SDS-PAGE(10%)分離后，將蛋白全部轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜放入用TBST配制的5% 脫脂奶封閉液中，室溫封閉1 h。然后加入按照1 ∶1 000稀釋的 I 抗，4 ℃孵育過(guò)夜。再用TBST清洗6次，每次5 min。加入稀釋好的 II 抗，室溫孵育1 h，TBST清洗6次，每次5 min。清洗好的膜放入暗盒上，正面朝上，加入顯影液，檢測(cè)蛋白。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549按照每孔1×104的密度接種于96孔板中，用不同濃度(25、50和100 mg/L)的吡咯烷螺二吲哚處理細(xì)胞24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑(2.5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光度(A)值。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗A549細(xì)胞2次，1 000 r/min離心收集細(xì)胞，用100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，然后分別加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，室溫避光孵育20 min，再加入1×Binding Buffer 400 μL。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，根據(jù)陰性對(duì)照組進(jìn)行設(shè)門及調(diào)節(jié)電壓，隨后分析細(xì)胞凋亡率，每次計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PSx抑制A549細(xì)胞活力

使用不同濃度的PSx預(yù)處理A549細(xì)胞24 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著PSx濃度的增加，A549細(xì)胞活力被顯著抑制，并呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.01),見(jiàn)圖1B。為了觀察PSx對(duì)A549 細(xì)胞形態(tài)的影響，使用倒置顯微鏡觀察并采集細(xì)胞圖像，結(jié)果顯示，相比于DMSO對(duì)照組，隨著PSx濃度的增加，A549細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的脫落和減少，見(jiàn)圖2。這些結(jié)果表明PSx對(duì)A549細(xì)胞活力具有顯著抑制作用。

2 PSx誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡

使用25、50和100 mg/L PSx處理A549細(xì)胞24 h，Annexin V/PI雙染細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞的凋亡率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著PSx濃度的增加，A549的細(xì)胞的存活率被顯著抑制，并呈現(xiàn)劑量依賴性，而細(xì)胞凋亡率也顯著上升(P<0.05或P<0.01)，表明PSx可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,見(jiàn)圖3。此外，使用25、50和100 mg/L PSx處理A549細(xì)胞24 h后，使用核酸染料DAPI 對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，在340 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，PSx處理的A549細(xì)胞有典型的核固縮的細(xì)胞凋亡形態(tài)，見(jiàn)圖4。

Figure 1.The chemical structure (A) of proline-spirooxindole (PSx) and its effect on the viability of A549 cells (B). Mean±SD.n=5.**P<0.01vsDMSO group.

圖1PSx的化學(xué)結(jié)構(gòu)及對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

Figure 2.The effect of proline-spirooxindole (PSx) on the morphological changes of A549 cells (×200).

圖2PSx對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響

Figure 3.The effect of proline-spirooxindole (PSx) on the apoptosis of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

圖3PSx對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4.The effect of proline-spirooxindole (PSx) on the morphological changes of the nuclei of A549 cells (×200).

圖4PSx對(duì)A549細(xì)胞核形態(tài)的影響

3 PSx對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響

為了驗(yàn)證PSx對(duì)細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響，使用25、50和100 mg/L PSx處理A549細(xì)胞24 h，Western blot法檢測(cè)了A549 細(xì)胞抑癌蛋白p53和DNA修復(fù)酶PARP的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，PSx可以顯著上調(diào)p53的表達(dá)，下調(diào)PARP并上調(diào)PARP切割產(chǎn)物的蛋白水平(P<0.01)。此外，使用25、50、100 mg/L PSx處理A549細(xì)胞24 h，檢測(cè)mTOR信號(hào)蛋白的磷酸化水平，結(jié)果顯示，PSx可以劑量依賴性地抑制mTOR的磷酸化水平(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5. The effect of PSx on the apoptotis-related proteins in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsDMSO group.

圖5PSx對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

討 論

研究表明，螺旋吲哚類化合物具有多種生物學(xué)活性，如吡咯烷基吲哚類化合物可以抑制人類前列腺癌細(xì)胞的增殖[7-8]；吲哚螺環(huán)-吡咯嘧啶類化合物通過(guò)抑制AKT的表達(dá)，能減緩腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)[9]；此外，一些吲哚螺環(huán)化合物可以作為法呢?；D(zhuǎn)移酶(farnesyltransferase，F(xiàn)TIs)抑制劑，有顯著抗腫瘤作用[10]，因此螺旋吲哚類衍生物具有潛在的抗腫瘤活性。在本研究中，我們通過(guò)氨基酸脂和靛紅的級(jí)聯(lián)反應(yīng)得到一種新型的螺旋吲哚衍生物，并評(píng)估了其對(duì)非小細(xì)胞癌的抑制作用。結(jié)果顯示，該化合物可以直接抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)，改變細(xì)胞形態(tài)并誘導(dǎo)A549細(xì)胞核出現(xiàn)典型的細(xì)胞核固縮形態(tài)。此外，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了Annexin V/PI雙染的A549細(xì)胞，可以也觀察到PSx對(duì)其A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種Ser/Thr蛋白激酶[11-14]，作為ATP和氨基酸水平的傳感器來(lái)平衡細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)于調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要[15-17]。mTOR在Ser2448殘基處偶聯(lián)PI3激酶/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑磷酸化，并在Ser2481處自磷酸化[18]。mTOR在細(xì)胞生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)平衡中起關(guān)鍵作用，并可能在腫瘤中異常表達(dá)。 因此，mTOR可作為抗腫瘤治療的潛在靶位[19]。本研究檢測(cè)了PSx對(duì)A549細(xì)胞的mTOR Ser2481位點(diǎn)磷酸化水平的影響，結(jié)果顯示PSx可以有效抑制mTOR的磷酸化，提示mTOR可能是PSx抑制A549細(xì)胞活性的作用靶位。此外，本研究觀察了PSx對(duì)抑癌基因TP53產(chǎn)物p53轉(zhuǎn)錄因子的影響。 p53作為DNA損傷的檢查點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞損傷情況，其激活可阻滯細(xì)胞周期并進(jìn)行進(jìn)一步的DNA修復(fù)，或修復(fù)失敗直接促使細(xì)胞凋亡[20]。PSx可以顯著誘導(dǎo)p53的表達(dá)及DNA修復(fù)酶發(fā)生切割，我們推測(cè)PSx加入后會(huì)誘導(dǎo)p53的表達(dá)，從而激活相關(guān)凋亡信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致DNA修復(fù)酶發(fā)生切割。

綜上所述，本研究在體外證實(shí)了吡咯烷螺二吲哚具有抗非小細(xì)胞肺癌的潛在活性，為該類化合物所具有生物活性的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，在本實(shí)驗(yàn)中，我們尚未探討該藥物是否會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓的改變。因?yàn)闈B透壓的改變對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡會(huì)產(chǎn)生影響，在后續(xù)的研究中我們要排除該藥物可能對(duì)滲透壓的影響，并進(jìn)一步研究PSx作為抗腫瘤藥物的具體作用機(jī)制。