焦 鵬， 黃振州， 張曉靜， 龍妍君， 李召君, 3， 王鳳澤△

(泰山醫(yī)學院 1生命科學研究中心,2生命科學學院, 3藥學院， 山東 泰安 271016)

腦瘤是一種嚴重威脅人類生存與健康的疾病。近幾年，我國每年新增腦部腫瘤病例約10萬，其中死亡人數約6.1萬[1]。在原發(fā)性腦腫瘤中，神經膠質瘤約占50%，是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一。目前，手術治療及術后輔以放療或化療仍然是膠質瘤主要的臨床治療手段[2-3]。腦腫瘤侵襲性很高，大多呈浸潤性，腫瘤組織邊界模糊，手術很難做到完全切除，復發(fā)率依然居高不下[4]。另外，放療的副作用較大，患者生活質量差。因此，尋求毒副反應小且經濟安全的新型藥物成為現階段膠質瘤治療的新趨勢。

CUDC-907是一種新型組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)雙靶點抑制劑，能夠有效地殺傷腫瘤細胞，在淋巴瘤等實體瘤中呈現良好的生物活性，同時能夠逆轉鉑類抗腫瘤藥物的耐藥性[5-7]。本研究以人神經膠質細胞瘤U251細胞為實驗對象，檢測CUDC-907對U251細胞DNA損傷和細胞周期的影響，同時探討CUDC-907誘導的細胞自噬與DNA損傷的相關性，為治療神經系統(tǒng)腫瘤疾病提供新思路。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

CUDC-907購自Selleck Chemicals；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、氯喹(chloroquine，CQ)和抗β-actin抗體購自Sigma；抗p70核糖體蛋白S6激酶(p70 ribosomol protein S6 kinase, p70s6K)、p53、細胞分裂周期蛋白2(cell division cycle protein 2, Cdc2)和p21抗體購自Santa Cruz；抗Akt、p-p70s6K和p-Cdc2抗體購自Cell Signaling Technology；抗p-Akt和γ-H2AX 抗體購自Abcam；HRP 標記的II抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠熒光II 抗購自Thermo Fisher。

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng) 人膠質瘤細胞株U251購于上海中科院細胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2MTT法檢測細胞活力 接種U251細胞于96孔板中，用不同劑量(0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5和5 μmol/L)的CUDC-907處理24 h。終止培養(yǎng)前4 h每孔加入20 μL的MTT(5 g/L)。吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO并振蕩5 min，在490 nm波長下測定吸光度(A)值，并對結果進行統(tǒng)計分析。

2.3流式細胞術檢測細胞周期 不同濃度的CUDC-907作用細胞24 h后，胰酶消化并收集細胞，然后加入預冷的75%無水乙醇，于-20 ℃固定過夜。800 r/min 離心5 min，棄上清后用PBS洗細胞2次；加入RNase A 于37 ℃ 孵育30 min；然后加入PI避光染色10 min，上機檢測分析各組細胞的周期分布。

2.4Western blot實驗 U251細胞經CUDC-907作用24 h 后，PBS洗滌2次，用預冷的RIPA蛋白裂解液(含有蛋白酶抑制劑)冰上裂解20 min,13 000 r/min離心 20 min，收集上清并用BCA法定量。取約30 μg的蛋白進行SDS-PAGE，然后將蛋白質電轉至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h， 加入I抗4 ℃孵育過夜，然后加入II抗室溫孵育1 h，用ECL 顯色后使用凝膠成像系統(tǒng)進行成像。

2.5免疫熒光染色 接種細胞至放有蓋玻片的6 孔板進行爬片培養(yǎng)，然后用不同濃度的CUDC-907處理細胞24 h。PBS洗滌玻片2 次， 4%多聚甲醛室溫固定20 min，Triton X-100 破膜后用山羊血清室溫封閉30 min，加入小鼠抗人γ-H2AX 單克隆抗體于室溫孵育2 h，再加入熒光II 抗37 ℃避光孵育1 h，DAPI染色5 min并封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，細胞核內出現的綠色灶點即為γ-H2AX焦點，藍色熒光為細胞核。

2.6GFP-LC3質粒轉染及熒光檢測 接種U251細胞于6孔板中，當細胞生長至80%左右時，用Lipfectamine 2000轉染GFP-LC3質粒，轉染方法參照說明書。轉染6 h 后換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉染24 h后，用不同濃度的CUDC-907處理細胞24 h，對照組加入DMSO。倒置熒光顯微鏡下進行觀察實驗結果，并拍照分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，實驗所得數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 CUDC-907抑制 U251細胞活力

MTT實驗結果顯示，不同濃度CUDC-907處理U251細胞24 h后，細胞活力均顯著下降，半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)=1.84 μmol/L，且其對細胞活力的抑制作用呈劑量依賴性(P<0.05),見圖1。

2 CUDC-907抑制PI3K/Akt信號通路

本研究首先檢測CUDC-907對PI3K/Akt信號通路的影響。Western blot實驗結果表明，在CUDC-907處理的細胞中，Akt和p70s6K的磷酸化水平較對照組明顯降低(P<0.05),見圖2，表明CUDC-907能夠顯著抑制PI3K/Akt信號通路。

Figure 1.The inhibitory effect of CUDC-907 on the viability of U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1CUDC-907抑制U251細胞活力

3 CUDC-907增加細胞內γ-H2AX焦點的生成

為了確定CUDC-907是否誘導DNA發(fā)生損傷，本研究檢測了CUDC-907對U251細胞內DNA損傷標志分子γ-H2AX焦點數目的影響。從結果中可以看出，U251細胞經CUDC-907作用后，γ-H2AX的焦點數目明顯增多(P<0.05)，表明CUDC-907可誘導U251細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂，見圖3。用Western blot實驗檢測了CUDC-907對γ-H2AX蛋白表達的影響，發(fā)現在CUDC-907處理的細胞中，γ-H2AX呈高表達趨勢(P<0.05)，進一步說明CUDC-907對U251細胞DNA損傷的誘導作用,見圖4。

4 CUDC-907誘導U251細胞發(fā)生G2/M期阻滯

采用流式細胞術觀察了CUDC-907對U251細胞周期的影響，結果顯示，CUDC-907處理U251細胞24 h后，處于G2/M期的細胞數量明顯增多，而S期的細胞數量則相應減少(P<0.05),見圖5。

Figure 2.CUDC-907 inhibited the phosphorylation of Akt and p70s6K in the U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2CUDC-907抑制Akt和p70s6K的磷酸化

Figure 3.Assessment of CUDC-907-induced DNA damage in U251 cells through an immunofluorescence γ-H2AX focus assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖3CUDC-907誘導U251細胞內γ-H2AX焦點的生成

Figure 4.The effect of CUDC-907 on the protein expression of γ-H2AX in the U251 cells was determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖4Westernblot檢測γ-H2AX的蛋白表達

Western blot實驗檢測了CUDC-907對細胞周期相關蛋白表達及活性的影響,結果可見，U251細胞經CUDC-907處理24 h后，p21的蛋白表達水平明顯升高，細胞周期素B1(cyclin B1)的表達則受到抑制，但p53表達水平未見明顯變化，同時Cdc2的磷酸化水平明顯降低(P<0.05),見圖6。

5 抑制自噬促進CUDC-907誘導的DNA損傷

當細胞發(fā)生自噬時，GFP-LC3 融合蛋白轉移至細胞自噬體膜，形成明亮的綠色斑點。轉染GFP-LC3 質粒的U251細胞經CUDC-907處理24 h后，細胞內呈點狀分布的GFP-LC3融合蛋白表達增加，表明CUDC-907 能夠促進U251膠質瘤細胞發(fā)生自噬，見圖7。Western blot實驗結果表明，與對照組相比，CUDC-907處理組LC3-II/LC3-I比例明顯增加(P<0.05)，進一步說明CUDC-907能夠誘導U251細胞發(fā)生自噬,見圖8。

自噬影響細胞內DNA損傷修復過程[8]。當采用自噬抑制劑氯喹(10 μmol/L)與CUDC-907(0.1 μmol/L)聯合處理細胞后，Western blot實驗發(fā)現γ-H2AX的表達水平明顯升高(P<0.05)，說明抑制自噬促進了CUDC-907誘導的DNA 損傷應答,見圖9。

Figure 5.The effect of CUDC-907 on the cell cycle distribution in U251 cells was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖5CUDC-907對U251細胞周期的影響

討 論

在腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，PI3K/Akt信號通路發(fā)揮著極為重要的作用，能夠促進膠質瘤的生長與侵襲轉移等過程[9]；同時，該信號途徑還參與調控細胞自噬及腫瘤放化療敏感性等[10]。組蛋白乙酰化和去乙酰化修飾是一種動態(tài)平衡過程，在染色體結構修飾及調節(jié)轉錄因子的轉錄活性中發(fā)揮著重要作用。組蛋白的乙?；潭仁怯山M蛋白轉移酶和組蛋白去乙?；竻f(xié)調控制[11]。腫瘤細胞中的HDAC 常過量表達，致使組蛋白過度乙?；?，導致核小體結構變得緊密，使得轉錄受到抑制，從而引發(fā)腫瘤[12]。

Figure 6.The effect of CUDC-907 on the expression of cell cycle regulatory proteins in the U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖6CUDC-907對細胞周期相關蛋白表達的影響

Figure 7.The expression of GFP-LC3 in the U251 cells transfected with GFP-LC3 plasmid. After transfection for 24 h, the cells were treated with CUDC-907 at different concentrations for another 24 h.

圖7CUDC-907對U251細胞中GFP-LC3融合蛋白表達的影響

Figure 8.Treatment of CUDC-907 increased the expression of LC3-II in the U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖8CUDC-907促進自噬標志分子LC3-II的表達

本研究發(fā)現HDAC和PI3K雙重抑制劑CUDC-907能夠有效抑制U251細胞中PI3K/Akt信號通路，同時誘導DNA損傷應答。DNA損傷應答是細胞應對外界不利影響的一種防御性反應，當DNA 損傷應答發(fā)生時，常伴隨著細胞凋亡和細胞周期阻滯等[13]。我們的研究結果表明，不同濃度的CUDC-907處理U251細胞后，DNA損傷應答標志分子γ-H2AX 的焦點數量增多，同時γ-H2AX的表達水平升高，表明CUDC-907能夠誘導U251 細胞發(fā)生DNA 損傷應答。

DNA 損傷發(fā)生后，細胞往往通過阻滯細胞周期進程而修復損傷的DNA，如果DNA受損嚴重則細胞走向凋亡或壞死。在本研究中我們發(fā)現，CUDC-907作用U251細胞后，處于G2/M期的細胞數量明顯增多，表明CUDC-907能夠誘導U251細胞發(fā)生G2/M期阻滯，且在CUDC-907處理的U251細胞中，p21蛋白的表達水平上調，而cyclin B1的蛋白表達則下調，同時Cdc2的磷酸化受到抑制，表明CUDC-907誘導的G2/M期阻滯可能與其調控上述細胞周期相關蛋白的表達與磷酸化修飾相關。

Figure 9.Suppression of autophagy accelerated CUDC-907-induced γ-H2AX expression. The cells were treated with CUDC-907 at 0.1 μmol/L and/or CQ at 10 μmol/L for 24 h, the protein level of γ-H2AX was determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group (untreated cells);#P<0.05vsCUDC-907-treated group.

圖9抑制自噬促進CUDC-907誘導的γ-H2AX表達

細胞自噬是細胞的一種自我保護機制，是真核細胞將細胞內受損、變性和衰老的蛋白質以及細胞器運輸到溶酶體進行消化降解，進而維持細胞內穩(wěn)態(tài)的一種蛋白質降解途徑[14]。細胞自噬與DNA 損傷應答關系密切：一方面，DNA 損傷能誘導細胞自噬的發(fā)生；另一方面，自噬調節(jié)多種損傷修復關鍵酶的表達而促進細胞修復受損的DNA[15]。本研究發(fā)現，CUDC-907能夠誘導U251 細胞發(fā)生自噬。當自噬抑制劑氯喹聯合CUDC-907處理U251細胞后，γ-H2AX 的表達水平明顯升高，說明CUDC-907誘導的自噬可能是保護性自噬。CUDC-907和自噬抑制劑的聯合應用可能為膠質瘤的臨床治療提供新策略。