邵揚謙， 周 斌， 孫加強， 張宇軒， 秦建武△

(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院 1甲狀腺頭頸外科， 2分子病理科室， 河南 鄭州 450008; 3鄭州大學第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結合科， 河南 鄭州 450052)

白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)是一種與腫瘤微環(huán)境相關的細胞因子，可由巨噬細胞、T淋巴細胞和血管內(nèi)皮細胞等多種細胞產(chǎn)生，其在乳腺癌、結腸癌和非小細胞肺癌多種腫瘤組織和細胞中異常表達，參與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等過程，與腫瘤的發(fā)展關系密切[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌患者外周血中IL-6水平明顯升高，與甲狀腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移關系密切[4]。甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)和頭頸部惡性腫瘤，具有增長迅速、發(fā)病率高和復發(fā)率高等特點，隨著其發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)的不斷增加，使得人們對甲狀腺癌機制的認識和診斷治療尤為迫切。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌的重要病理類型，約占其90%，頸部淋巴結轉(zhuǎn)移是其重要的臨床特征，尋找有效抑制腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移的靶標一直是甲狀腺乳頭狀癌研究的重點[5]。EMT是一種賦予上皮細胞轉(zhuǎn)移和入侵能力的生物學過程，在腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。長鏈非編碼RNA lncTCF7在大腸癌和非小細胞肺癌等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著促進作用[6-7]。已有研究證實，IL-6可通過激活STAT3上調(diào)lncTCF7表達促進肝細胞癌EMT[8]；IL-6也可促進未分化型甲狀腺癌腫瘤干細胞增殖[9]，但其對甲狀腺乳頭狀癌細胞EMT、遷移和侵襲能力的影響未見報道。因此，本研究以人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞為研究對象，探討IL-6通過誘導lncTCF7表達對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞的EMT、遷移和侵襲能力的影響，以期為甲狀腺乳頭狀癌的治療提供新的線索。

材 料 和 方 法

1 細胞、試劑與儀器

人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞購于ATCC。DMEM培養(yǎng)基購于Gibco；胎牛血清購于杭州四季青公司；胰蛋白酶購于碧云天生物技術研究所；si-lncTCF7-1序列(5’-AGCCAACATTGTTGGTTAT-3’)、si-lncTCF7-2序列(5’-CACCTAGGTGCTCACTGAA-3’)及其陰性對照序列(5’-UUCUCCGAACG-UGUCACGUTT-3’)、lncTCF7過表達質(zhì)粒及其空載體質(zhì)粒均購于GenePharma；TRIzol試劑和Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；抗E-cadherin、vimentin、Snail、Slug和GAPDH抗體購于CST；羊抗兔/鼠IgG-HRP II 抗和BCA蛋白檢測試劑盒購于南京凱基生物公司；PCR試劑盒購自Abm；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；Transwell小室購于Corning；PVDF膜購于PALL。CO2細胞培養(yǎng)箱購于Thermo；PCR 擴增儀購于ABI；電泳儀購于北京六一儀器廠；凝膠成像分析儀購于UVP；倒置相差顯微鏡購于廈門麥克奧迪公司。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)及處理 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)TPC-1細胞,每2 d換液1次，待細胞貼壁達瓶底80%左右時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集生長狀態(tài)良好的第3～5代對數(shù)生長期TPC-1細胞進行實驗。 取對數(shù)期生長期的TPC-1細胞，以每孔3×106個細胞接種于96孔板上，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜后，將其隨機分為5組，分別加入終濃度為0、5、10、20和50 μg/L的IL-6反應24 h后，收集各組細胞，采用RT-qPCR檢測TPC-1細胞中l(wèi)ncTCF7的表達情況;另接種一板TPC-1細胞，培養(yǎng)過夜后將其隨機分為4組，以同一濃度50 μg/L 的IL-6分別處理0、6、12和24 h后，收集各組細胞采用RT-qPCR檢測。

2.2RT-qPCR檢測 以TRIzol法提取TPC-1細胞總RNA后，參照逆轉(zhuǎn)錄說明書步驟合成cDNA。以cDNA為模板，再參照RT-qPCR試劑盒說明書步驟進行PCR擴增。其中，上海生工生物合成的lncTCF7的上游引物序列為5’-AGGAGTCCTTGGACCTGAGC-3’，下游引物序列為5’-AGTGGCTGGCATATAACCAACA-3’；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列為5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3’。按照如下PCR擴增條件進行擴增：95 ℃預變性120 s；95 ℃ 變性15 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃總延伸300 s。采用2-ΔΔCt法檢測TPC-1細胞中l(wèi)ncTCF7的表達水平。

2.3Western blot檢測蛋白水平 收集方法2.1中0 μg/L和50 μg/L IL-6作用24 h后的2組TPC-1細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白后，參照BCA蛋白檢測試劑盒對總蛋白進行濃度和純度的檢測。取定量合格的總蛋白，加入等量的上樣緩沖液充分混勻后，于沸水浴中變性5 min。取適量的變性蛋白上樣行SDS-PAGE，待分離結束后，采用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白樣品轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，接著放入含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h。用封閉液稀釋1 000倍的抗E-cadherin、vimentin和GAPDH抗體常溫孵育1 h后，以封閉液按照每次10 min洗膜3次；再用封閉液稀釋2 000倍的HRP-羊抗鼠/兔 II 抗常溫孵育1 h。以封閉液洗膜后，滴加化學發(fā)光劑，大約30 s后，置于成像儀的暗室內(nèi)曝光，拍照分析。后期采用Wes-tern blot檢測敲減lncTCF7表達對IL-6誘導的EMT相關因子Snail和Slug的蛋白表達情況，其中抗Snail和Slug抗體的稀釋倍數(shù)為800。

2.4細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的TPC-1細胞以每孔105個細胞接種至6孔細胞板上，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞融合度達70%以上時，進行瞬時轉(zhuǎn)染。參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000的說明書步驟將lncTCF7過表達質(zhì)粒及其空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至TPC-1細胞中，并標記為lncTCF7組和vector組。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),48 h后收集各組細胞，采用Western blot檢測TPC-1細胞中E-cadherin和vimentin蛋白表達的影響。后期實驗采用Lipofectamine 2000將si-lncTCF7-1、si-lncTCF7-2及其陰性對照序列轉(zhuǎn)染至TPC-1細胞中，分別標記為si-lncTCF7-1組、si-lncTCF7-2和si-Con組,轉(zhuǎn)染48 h后，采用RT-qPCR檢測其轉(zhuǎn)染效果。另在轉(zhuǎn)染48 h后，給予50 μg/L IL-6處理24 h，并設一組不加IL-6的si-Con組細胞作為對照，采用Western blot檢測各組細胞中E-cadherin和vimentin蛋白的表達，Transwell小室實驗檢測各組細胞的遷移和侵襲能力。

2.5Transwell小室實驗 細胞遷移實驗：將lncTCF7組和vector組細胞常規(guī)消化后，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基制備1×108/L的細胞懸液。于24孔板Transwell小室上室中加入200 μL細胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。每組實驗重復3次。置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h后，取出小室，分別加入10%甲醇和0.1%結晶紫溶液固定、染色,晾干后，于倒置顯微鏡下觀察、拍照。各組細胞遷移能力以隨機選取的6個視野的細胞數(shù)的平均值表示。細胞侵襲實驗：實驗前，以濃度為1 g/L 的Matrigel對Transwell小室上室聚碳酸酯微孔膜進行包被，于培養(yǎng)箱內(nèi)聚合反應30 min后，在小室上室中加入細胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，取出小室，以甲醇和結晶紫對細胞進行固定和染色，倒置顯微鏡下拍照分析。詳細步驟參照遷移實驗。

2.6相差顯微鏡觀察細胞形態(tài) 采用相差顯微鏡觀察待測的TPC-1細胞形態(tài)并拍照，觀察敲減lncTCF7表達對IL-6誘導的TPC-1細胞形態(tài)的影響。

3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)的形式表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 IL-6誘導TPC-1細胞中l(wèi)ncTCF7的表達

RT-qPCR檢測結果顯示，以不同濃度(0、5、10、20和50 μg/L)的IL-6作用24 h后，與0 μg/L對照組相比，TPC-1細胞中l(wèi)ncTCF7表達隨著IL-6濃度的增加逐漸升高(P<0.05)；以50 μg/L的IL-6作用0、6、12和24 h后，TPC-1細胞中l(wèi)ncTCF7表達隨著IL-6作用時間的延長逐漸升高(P<0.05)，見圖1。可見，IL-6可呈劑量和時間依賴性地誘導TPC-1細胞中l(wèi)ncTCF7表達。

Figure 1.The effects of IL-6 on the expression of lncTCF7 in the TPC-1 cells. A: the TPC-1 cells were treated with different concentrations of IL-6 for 24 h; B: the TPC-1 cells were treated with 50 μg/L IL-6 for different time. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L group;#P<0.05vs0 h group.

圖1IL-6對TPC-1細胞中l(wèi)ncTCF7表達的影響

2 IL-6誘導TPC-1細胞的EMT

Western blot檢測結果顯示，與未加IL-6的TPC-1細胞相比，以50 μg/L IL-6作用24 h后，TPC-1細胞中上皮標志物E-cadherin表達明顯降低，間充質(zhì)標志物vimentin表達明顯升高(P<0.05)，見圖2。 這說明IL-6可誘導TPC-1細胞的EMT。

Figure 2.The effect of IL-6 on epithelial-mesenchymal transition of TPC-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIL-6 (-) group.

圖2IL-6對TPC-1細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

3 過表達lncRNA-TCF7可促進TPC-1細胞的EMT

Western blot檢測結果顯示，與vector組相比，在轉(zhuǎn)染lncTCF7過表達質(zhì)粒的lncTCF7組細胞中E-cadherin表達明顯降低，而vimentin蛋白表達明顯升高(P<0.05),見圖3。這說明過表達lncTCF7可促進TPC-1細胞的EMT。

Figure 3.The effect of lncTCF7 over-expression on epithelial-mesenchymal transition of TPC-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

圖3過表達lncTCF7對TPC-1細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

4 過表達lncTCF7可促進TPC-1細胞的遷移和侵襲能力

Transwell實驗檢測結果顯示，與vector組相比，轉(zhuǎn)染lncTCF7過表達質(zhì)粒的lncTCF7組細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)均明顯升高(P<0.05)，見圖4。這說明過表達lncTCF7可促進TPC-1細胞的遷移和侵襲能力。

5 敲減lncTCF7表達抑制了IL-6誘導的TPC-1細胞EMT、遷移和侵襲

RT-qPCR檢測結果顯示，與si-Con組相比，si-lncTCF7-1組和si-lncTCF7-2組細胞中l(wèi)ncTCF7的表達水平均明顯降低(P<0.05),見圖5A。Western blot檢測和Transwell實驗結果顯示，與si-Con+IL-6(-)組相比，給予50 μg/L IL-6作用的si-Con+IL-6(+)組細胞中E-cadherin蛋白表達下調(diào)，而vimentin蛋白表達上調(diào)，同時遷移和侵襲細胞數(shù)均增多(P<0.05)；與si-Con+IL-6(+)組相比，在成功敲減lncTCF7表達的si-lncTCF7-1組和si-lncTCF7-2組細胞中E-cadherin蛋白表達上調(diào)，而vimentin蛋白表達下調(diào)，同時，遷移和侵襲細胞數(shù)均減少(P<0.05)，見圖5B、C?？梢娗脺plncTCF7表達能夠明顯抑制IL-6誘導的TPC-1細胞EMT、遷移和侵襲。

6 敲減lncTCF7表達抑制了IL-6對TPC-1細胞形態(tài)和EMT相關分子蛋白水平的影響

Figure 4.The effects of lncTCF7 over-expression on the migration and invasion abilities of TPC-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

圖4過表達lncRNA-TCF7對TPC-1細胞遷移和侵襲能力的影響

Figure 5.The effects of lncTCF7 knockdown on IL-6-induced epithelial-mesenchymal transition, migration and invasion of TPC-1 cells. A: lncTCF7 knockdown in the TPC-1 cells; B: the result of Western blot for determining the protein expression of E-cadherin and vimentin; C: the number of migratory and invasive cells in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-Con group;△P<0.05vssi-Con+IL-6 (-) group;#P<0.05vssi-Con+IL-6 (+) group.

圖5敲減lncTCF7的表達對IL-6誘導的TPC-1細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲能力的影響

光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，與si-Con+IL-6(-)組相比，給予50 μg/L IL-6作用的si-Con+IL-6(+)組的TPC-1細胞由鵝卵石狀變?yōu)榧忓N體狀，且細胞間隙加大,連接松散;而敲減lncTCF7表達后，IL-6引起的上述變化明顯受到抑制，見圖6A。同時，Western blot進一步檢測EMT轉(zhuǎn)錄因子Slug和Snail蛋白的表達，與si-Con+IL-6(-)組相比，si-Con+IL-6(+)組TPC-1細胞中Slug和Snail蛋白的表達水平均明顯升高，而si-lncTCF7+IL-6(+)組中Slug和Snail蛋白的表達水平較si-Con+IL-6(+)組均明顯降低(P<0.05)，見圖6B?？梢姡脺plncTCF7表達能夠明顯抑制IL-6對TPC-1細胞形態(tài)和EMT相關分子蛋白水平的影響。

討 論

IL-6是一種常見的多種功能細胞因子，在腫瘤細胞微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，可通過多種途徑直接或間接作用于腫瘤細胞，參與眾多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，而抑制其表達有望成為治療癌癥的重要策略[10-11]。IL-6在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達異常升高，且與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤和淋巴結轉(zhuǎn)移有關，可作為子宮內(nèi)膜癌發(fā)展監(jiān)測指標和治療靶點[12]；星形膠質(zhì)細胞分泌的IL-6可通過上調(diào)MMP-14表達促進膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲[13]；IL-6通過STAT3信號通路促進胃癌和卵巢癌的遷移和侵襲，沉默其表達則能夠降低腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力[14-15]；此外，IL-6可通過上調(diào)lncTCF7表達促進肝細胞癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]。lncTCF7是一種新發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA，其異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預后不良等關系密切[16],例如，lncTCF7在腦膠質(zhì)瘤和結直腸癌中高表達，其表達水平越高，患者的生存預后越差，其可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進腫瘤的細胞增殖、遷移和侵襲；另外，lncTCF7可被IL-6/STAT3反式激活通過調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進肝癌細胞的侵襲[8]；而敲減其表達則能夠明顯抑制腫瘤細胞的遷移、增殖和致瘤性[6,17]。已有研究[8, 18-19]指出，IL-6在甲狀腺乳頭狀癌中異常高表達，與癌灶的包膜侵犯有關；然而IL-6有無通過誘導lncTCF7表達參與甲狀腺乳頭狀癌細胞的EMT、遷移和侵襲過程,目前并不清楚。

Figure 6.Knockdown of lncTCF7 expression inhibited the morphological changes and the protein levels of epithelial-mesenchymal transition-related molecules of TPC-1 cells induced by IL-6. A: morphological changes of the TPC-1 cells with/without IL-6 treatment after knockdown of lncTCF7 expression (×100); B: the protein expression of Snail and Slug in the TPC-1 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-Con+IL-6 (-) group;#P<0.05vssi-Con+IL-6 (+) group.

圖6敲減lncTCF7的表達抑制了IL-6誘導的TPC-1細胞形態(tài)改變和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關分子蛋白水平的變化

我們以不同濃度的IL-6作用24 h或以50 μg/L的IL-6作用不同時間后，RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，IL-6可呈劑量和時間依賴性地誘導甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中l(wèi)ncTCF7的表達；以50 μg/L IL-6作用24 h后，Western blot檢測TPC-1細胞中E-cadherin表達明顯降低，vimentin表達明顯升高。E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，在形成細胞間黏附性連接過程中發(fā)揮著重要作用，其下調(diào)可造成細胞間黏附性連接減弱，促進細胞的遷移和侵襲，常被作為EMT的上皮標志物；vimentin是一種中間絲蛋白，存在于間充質(zhì)細胞中，在間充質(zhì)來源的細胞中顯示陽性，上皮來源細胞中顯示陰性，可通過調(diào)節(jié)細胞黏附分子和細胞骨架蛋白等參與細胞信號轉(zhuǎn)導、黏附、遷移和侵襲等過程，常被作為EMT的間充質(zhì)標志物；兩者均在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[20-21]。上述結果提示，IL-6可能夠通過誘導lncTCF7表達促進甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展。轉(zhuǎn)染lncTCF7過表達質(zhì)粒后，TPC-1細胞中E-cadherin表達降低，vimentin表達升高，同時TPC-1細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)減少，提示，lncTCF7在甲狀腺乳頭狀癌的EMT、遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要的促進作用。為了驗證lncTCF7在IL-6促進甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展中的作用，我們通過轉(zhuǎn)染si-lncTCF7-1序列成功敲減其表達后，檢測發(fā)現(xiàn)IL-6作用后TPC-1細胞中E-cadherin表達下降、vimentin表達上調(diào)、遷移和侵襲細胞數(shù)增多且細胞間隙增大這一系列變化均受到抑制。Slug和Snail是轉(zhuǎn)錄因子Snail超家族成員，可與E-cadherin啟動子區(qū)域的E-box結合進而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，進而影響細胞的EMT。結果提示，IL-6通過誘導lncTCF7表達促進甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞的EMT、遷移和侵襲能力。

綜上所述，IL-6和lncTCF7均在甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞的EMT、遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要的促進作用，但其具體的調(diào)控機制還有待進一步深入研究。這為靶向IL-6或lncTCF7抗甲狀腺乳頭狀癌轉(zhuǎn)移提供了參考依據(jù)。