趙 靜， 翟 鐵， 梁宏霞

(1唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系， 河北 唐山 063000； 2承德市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科， 河北 承德 067000)

糖尿病腎病是常見的糖尿病并發(fā)癥之一，高血糖是誘發(fā)糖尿病腎病發(fā)生的關(guān)鍵。糖尿病腎病的發(fā)生與腎小管上皮細(xì)胞損傷有關(guān)，腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷、炎性損傷和細(xì)胞凋亡等是腎小管上皮細(xì)胞損傷的重要組成部分[1]。Netrin-1是一種神經(jīng)導(dǎo)向因子，具有抑制組織炎癥和促進(jìn)血管生成等作用，對(duì)腎組織損傷具有保護(hù)作用[2-3]。Netrin-1具有保護(hù)腎組織的作用，阻斷netrin-1的糖尿病小鼠發(fā)生更為嚴(yán)重的腎臟疾病，netrin-1還能夠抑制糖尿病腎病患者炎癥等的發(fā)生[4-5]。本實(shí)驗(yàn)用慢病毒感染的方法提高腎小管上皮細(xì)胞中netrin-1的表達(dá)水平，探討netrin-1在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用，為明確糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 主要材料

人腎小管上皮HK-2細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。cDNA第一鏈合成試劑盒購自Biomiga；SYBR Green Realtime PCR試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司；抗netrin-1抗體購自Bioworld；抗cleaved caspase-3抗體購自Santa Cruz；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測(cè)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒購自Abnova；白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞中netrin-1表達(dá)的影響 HK-2細(xì)胞分別用含5.5 mmol/L[對(duì)照(control)組]和30 mmol/L葡萄糖[高糖(high glucose，HG)組]的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，以real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞中netrin-1的表達(dá)水平。

2.2慢病毒感染和分組 HK-2細(xì)胞分成4組:(1)control組：不做慢病毒感染的HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含有5.5 mmol/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液中；(2)HG組：不做慢病毒感染的HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含有30 mmol/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液中；(3)陰性對(duì)照慢病毒(negative control, NC)+HG組：陰性對(duì)照慢病毒感染的HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含有30 mmol/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液中；(4)netrin-1+HG組：過表達(dá)netrin-1慢病毒感染的HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含有30 mmol/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液中。慢病毒感染步驟簡(jiǎn)述如下：HK-2細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，細(xì)胞匯合度為30%～50%時(shí)，將培養(yǎng)液上清吸棄，加入適量的病毒液(MOI=30)，培養(yǎng)12 h后，將病毒液吸棄，細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，用嘌呤霉素篩選抗性細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中netrin-1表達(dá)水平，檢測(cè)過表達(dá)效果。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)48 h以后，在細(xì)胞中添加0.25%的胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000×g離心10 min。把上清溶液吸棄以后，以PBS將各組細(xì)胞洗滌3次。在細(xì)胞中添加200 μL的binding buffer混合后，添加10 μL的Annexin V-FITC混合孵育15 min,再加入5 μL的PI染液，混勻后，在用流式細(xì)胞儀檢測(cè)前添加300 μL的binding buffer。

2.4Real-time PCR 取HK-2細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞中的總RNA，步驟參照TRIzol試劑說明書。提取的各組RNA用DEPC水溶解以后，分裝，在-80 ℃的冰箱中保存。提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280值在1.8～2.0之間。以cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，步驟同試劑盒說明書。cDNA置于-80 ℃的冰箱中保存。取cDNA，用SYBR Green Realtime PCR試劑盒進(jìn)行PCR，β-actin作為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt計(jì)算netrin-1水平。Netrin-1 的上游引物序列為5’-GGATCCATGCCGCGGAGGGGC-GCGGA-3’，下游引物序列為5’-GATTCCTACGCCTTCCTACACTTC-3’;β-actin的上游引物序列為5’-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’， 下游引物序列為5’-GAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’。

2.5Western blot檢測(cè)蛋白水平 取HK-2細(xì)胞，常規(guī)方法提取細(xì)胞中的總蛋白，用BCA法定量后，以每個(gè)泳道中加入30 μg蛋白計(jì)算，將蛋白同上樣緩沖液混合后，置于100 ℃煮沸變性。SDS-PAGE條件為 70 V電壓在濃縮膠中電泳，120 V電壓在分離膠中電泳。把凝膠取出，以90 V電壓將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜裝置置于冰上進(jìn)行。NC膜用5%牛血清白蛋白常規(guī)方法封閉以后，再與1∶400稀釋的netrin-1抗體在4 ℃過夜或室溫孵育2 h，與1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的 II 抗置于37 ℃結(jié)合2 h后，按照ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，以 ImageJ 測(cè)定條帶的灰度值，內(nèi)參照為β-actin，分析各組netrin-1蛋白表達(dá)變化。

各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)2 d以后，用上述Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中cleaved caspase-3水平，抗cleaved caspase-3蛋白抗體以1∶200稀釋。

2.6細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性和MDA含量的檢測(cè) 各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)48 h以后，吸取培養(yǎng)液上清，用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法檢測(cè)上清中MDA含量，TBA可以與MDA結(jié)合形成紅色物質(zhì)，檢測(cè)其在532 nm的A值可計(jì)算MDA含量。用2,4-二硝基苯肼法檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH活性，LDH能夠?qū)⑷樗岽呋杀?，丙酮酸能夠?,4-二硝基苯肼結(jié)合生成棕紅色物質(zhì)，通過比色可以計(jì)算出LDH活性。

2.7ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α含量 各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)48 h以后，吸取培養(yǎng)液上清，用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α含量，步驟同試劑盒說明書，在反應(yīng)孔內(nèi)加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品或者待測(cè)樣品，在空白對(duì)照孔內(nèi)添加100 μL的稀釋液，最后用空白對(duì)照孔調(diào)零以后，上酶標(biāo)儀檢測(cè)參比波長450 nm的A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算IL-1β和TNF-α含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行處理。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高糖抑制腎小管上皮細(xì)胞中netrin-1的表達(dá)

高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞中netrin-1的mRNA和蛋白水平較對(duì)照組均降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.High glucose inhibited the expression of netrin-1 in renal tubular epithelial cells. A: the mRNA expression level of netrin-1 in the renal tubular epithelial cells after high-glucose treatment; B: Western blot was used to detect the level of netrin-1 protein in renal tubular epithelial cells after high-glucose treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1高糖抑制腎小管上皮細(xì)胞中netrin-1的表達(dá)

2 過表達(dá)netrin-1提高高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞中netrin-1的表達(dá)水平

腎小管上皮細(xì)胞感染過表達(dá)netrin-1慢病毒載體后，經(jīng)高糖處理，細(xì)胞中netrin-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),說明過表達(dá)netrin-1慢病毒載體能夠提高高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞中netrin-1的表達(dá)水平，見圖2。

3 過表達(dá)netrin-1抑制高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞凋亡

高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高，同時(shí)細(xì)胞中活化的caspase-3水平也升高(P<0.05)，說明高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡；過表達(dá)netrin-1的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞中活化的caspase-3水平也降低(P<0.05)，提示netrin-1能夠降低高糖環(huán)境下的腎小管上皮細(xì)胞凋亡水平，見圖3。

4 過表達(dá)netrin-1降低高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH活性和MDA水平

高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性和MDA水平升高(P<0.05)，高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷;高表達(dá)netrin-1的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性和MDA水平降低(P<0.05)，netrin-1減輕高糖環(huán)境下的腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷，見表1。

5 高表達(dá)netrin-1降低高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平的變化

高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05)，說明高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷；高表達(dá)netrin-1的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05)，netrin-1減輕高糖環(huán)境下的腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷，見表1。

Figure 2.The effect of lentivirus infection on netrin-1 expression in the renal tubular epithelial cells in high-glucose environment. A: the effect of lentivirus infection on the mRNA level of netrin-1 in the renal tubular epithelial cells in high-glucose environment; B: Western blot was used to determine the protein level of netrin-1 in the renal tubular epithelial cells with lentivirus infection in high-glucose environment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHG group.

圖2慢病毒感染對(duì)高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞中netrin-1表達(dá)的影響

討 論

糖尿病腎病是一種慢性微血管并發(fā)癥，以往的研究認(rèn)定腎小球病變是其發(fā)生的主要機(jī)制，近年來發(fā)現(xiàn)腎小管病變與腎功能損傷關(guān)系更為密切，腎小管上皮細(xì)胞凋亡是腎小管病變發(fā)生的原因之一，其發(fā)生機(jī)制與氧化損傷和炎癥等多種因素有關(guān)[6-7]。高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷，糖尿病患者長期的高血糖誘發(fā)腎小管上皮細(xì)胞凋亡是腎功能障礙的關(guān)鍵誘因[8-11]。用高糖處理腎小管上皮細(xì)胞是最為常用的糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞損傷模型[12]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞凋亡增多，說明成功構(gòu)建了糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞損傷模型。

Netrin家族屬于可溶性的神經(jīng)導(dǎo)向因子，能夠促進(jìn)神經(jīng)元和軸突信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，netrin家族除了在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)以外，在胰腺、肺臟和乳腺等組織中也具有廣泛表達(dá)[13]。Netrin-1是netrin家族的成員，也是第一個(gè)被鑒定出來的netrin家族成員，在內(nèi)囊、脊髓和延髓等組織中廣泛表達(dá)，其具有誘導(dǎo)神經(jīng)軸突生長等作用[14-17]。另外，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等神經(jīng)系統(tǒng)以外的組織中也發(fā)現(xiàn)netrin-1的表達(dá)，其具有調(diào)控細(xì)胞增殖、形態(tài)改變和遷移等作用[18]。目前的研究表明，netrin-1與糖尿病、腎組織損傷、腫瘤和動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生有關(guān)，netrin-1具有抑制缺血再灌注腎臟組織細(xì)胞凋亡的作用，另外在腎組織纖維化中netrin-1也發(fā)揮保護(hù)作用[13,19-22]。本實(shí)驗(yàn)顯示，netrin-1在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)降低，并且上調(diào)其表達(dá)后可以減少高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞損傷，表明netrin-1具有腎小管上皮細(xì)胞保護(hù)作用。

糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞損傷的發(fā)生與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等有關(guān)，正常組織中存在較低水平的氧自由基，這些氧自由基在維持細(xì)胞氧化平衡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基過度積累時(shí)，就會(huì)引發(fā)存在于細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的LDH等進(jìn)入細(xì)胞外，MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和MDA含量可以間接反應(yīng)細(xì)胞氧化損傷程度[23]。腎臟組織炎癥是除了氧化應(yīng)激以外與腎小管上皮細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的誘導(dǎo)因素之一，IL-1β和TNF-α等炎癥因子能夠殺傷有害病原物的同時(shí)還能夠引起正常細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[24-25]。之前的研究報(bào)道稱，netrin-1具有抗炎和抗氧化等作用。本實(shí)驗(yàn)表明，netrin-1可以減少高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-α，同時(shí)減少細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和MDA水平，提示netrin-1可能具有抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷和氧化損傷的作用。

Netrin-1作為一種腎組織損傷保護(hù)因子，其具有減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用，在糖尿病腎病發(fā)生中發(fā)揮保護(hù)作用。這對(duì)于研究糖尿病腎病發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

Figure 3.Apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high-glucose was suppressed after up-regulation of netrin-1 expression. A: flow cytometry was used to detect the effect of netrin-1 on the apoptosis of renal tubular epithelial cells in high-glucose environment; B: the effect of netrin-1 on the protein level of cleaved caspase-3 in the renal tubular epithelial cells in high glucose environment was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsHG group.

圖3過表達(dá)netrin-1抑制高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞凋亡

表1上調(diào)netrin-1后的腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)高糖處理后細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH和MDA水平的變化

Table 1.The activity of LDH and the content of MDA, IL-1β and TNF-α in the culture supernatant of renal tubular epithelial cells treated with high glucose after up-regulation of netrin-1 expression (Mean±SD.n=3)

GroupLDH (×103 U/L)MDA (μmol/L)IL-1β (μg/L)TNF-α (μg/L)Control23.15±1.461.25±0.185.18±0.414.15±0.23HG39.52±2.17?2.18±0.13?16.74±1.46?12.96±1.17?NC+HG40.76±2.682.20±0.2516.82±1.2313.85±1.28Netrin-1+HG30.21±1.64&1.74±0.15&10.27±1.05&7.58±0.62&

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsHG group.