熊海濤，劉揚(yáng)科，張志華，董文聽，譙仕彥，張 江

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司，農(nóng)業(yè)部飼用抗生素替代技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南林州 456550；3.大同海關(guān)，山西大同 037004；4.國家飼料工程技術(shù)研究中心，北京100193）

腹瀉是仔豬生長受阻和死亡的重要原因，腹瀉引起的死亡占仔豬死亡率的50%以上，每年給廣大生豬養(yǎng)殖從業(yè)者造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元，防治仔豬腹瀉一直是備受關(guān)注的世界性問題。引起仔豬腹瀉的原因眾多，致病性細(xì)菌感染是重要原因之一，其中最常見的是大腸桿菌和沙門氏菌[1]。預(yù)防治療仔豬腹瀉的傳統(tǒng)方法是在飼料中添加抗生素，但近年來隨著抗生素的禁用，尋找抗生素替代品用于飼料中預(yù)防細(xì)菌性腹瀉已成為大勢(shì)所趨。

腸桿菌肽是1992年Raul等[2]發(fā)現(xiàn)的由21個(gè)氨基酸構(gòu)成索套結(jié)構(gòu)的抗菌肽，其分子量為2.1 ku，N端的8個(gè)氨基酸通過內(nèi)酰胺鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，9～21氨基酸形成β發(fā)夾結(jié)構(gòu)貫穿于環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。許多研究表明，腸桿菌肽對(duì)革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、沙門氏菌等）具有明顯的抑制作用[3]。本試驗(yàn)在哺乳仔豬和保育仔豬無抗日糧中添加腸桿菌肽，以探討腸桿菌肽對(duì)哺乳仔豬和保育仔豬生長性能、腹瀉率以及糞便中微生物的影響，為腸桿菌肽替代抗生素預(yù)防仔豬腹瀉提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)所使用的0.5%腸桿菌肽由林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司生產(chǎn)提供。

指示菌大腸桿菌（Escherichia coli, E.coli）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922購自于ATCC微生物菌株保藏中心，大腸桿菌野毒株AZ1、沙門氏菌野毒株sk226和沙門氏菌野毒株1791由國家獸藥評(píng)價(jià)中心提供，大腸桿菌W1和大腸桿菌W2分別是從腹瀉仔豬糞便分離的對(duì)硫酸粘桿菌素和慶大霉素耐藥的菌株。

1.2 牛津杯試驗(yàn)方法 根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的測(cè)定抗菌藥物對(duì)指示菌的最小抑菌濃度（MIC）方法[4]，接種菌量為5×106CFU/mL，牛津杯放入鋪有瓊脂的平板上，倒入含有指示菌的LB培養(yǎng)基，配置瓊脂LB培養(yǎng)基雙層平板，待凝固后，取出牛津杯，在牛津杯孔中分別加入200 μL的不同濃度的腸桿菌肽溶液。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量平板中的抑菌圈直徑。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧 試驗(yàn)選用杜×長×大三元雜交仔豬，參照美國NRC（1998）哺乳仔豬和保育豬的營養(yǎng)需要配合成粉狀全價(jià)料，基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)無抗日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 選擇日齡相同的4窩哺乳仔豬，隨機(jī)分為2組，每組2窩，每窩10頭仔豬，利用生長性能測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定每頭仔豬生長性能，對(duì)照組飼喂無抗基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂無抗基礎(chǔ)日糧+腸桿菌肽（300 mg/kg），哺乳階段仔豬試驗(yàn)期從5日齡至26日齡斷奶，保育階段仔豬試驗(yàn)從27日齡至79日齡。試驗(yàn)在菲律賓國際種豬繁育中心（International Training Center on Pig Husbandry）進(jìn)行。

3日齡時(shí)對(duì)每頭試驗(yàn)仔豬打耳標(biāo)，便于生長性能自動(dòng)測(cè)定系統(tǒng)識(shí)別，注射200 mg右旋糖酐鐵補(bǔ)鐵，同時(shí)對(duì)每頭仔豬進(jìn)行閹割去勢(shì)。試驗(yàn)期間，根據(jù)仔豬生長的不同階段設(shè)定生長性能自動(dòng)測(cè)定系統(tǒng)的參數(shù)；每天記錄仔豬的采食、飲水和增重情況，計(jì)算耗料增重比，觀察記錄腹瀉情況；保持豬舍的通風(fēng)清潔，做好豬舍的清掃消毒工作；免疫程序按照正常飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行。

1.5 糞便微生物計(jì)數(shù) 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（26日齡和79日齡時(shí)）采集仔豬糞便，取0.1 g糞便加入1 mL PBS，震蕩、離心后，PBS梯度稀釋后，采用平板活菌計(jì)數(shù)的方法[5]進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板（青島海博生物技術(shù)有限公司）上培養(yǎng)，沙門氏菌在SS瓊脂平板（青島海博生物技術(shù)有限公司）上培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h觀察計(jì)數(shù)，結(jié)果以每克糞便中菌落數(shù)量表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS 20.0軟件中單因素方差（One-Way ANOVA）分析，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 腸桿菌肽的體外抑菌試驗(yàn) 腸桿菌肽對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌結(jié)果見表2。腸桿菌肽對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和野毒株增殖均有明顯的抑制作用，且具有劑量依賴效應(yīng)，隨著腸桿菌肽濃度的變大，其抑菌圈直徑不斷變大。對(duì)大腸桿菌ATCC25922菌株，腸桿菌肽濃度為300 μg/mL時(shí)有明顯的抑菌圈，腸桿菌肽濃度為200 μg/mL時(shí)抑菌圈消失，表明腸桿菌肽對(duì)大腸桿菌ATCC25922的MIC為300 μg/mL，腸桿菌肽對(duì)大腸桿菌AZ1、大腸桿菌W1和W2的MIC均為200 μg/mL，腸桿菌肽對(duì)沙門氏菌SK226和沙門氏菌1791的MIC均為100 μg/mL。綜上所述，腸桿菌肽對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的MIC在100～300 μg/mL。

2.2 腸桿菌肽對(duì)仔豬生長性能的影響 由表3可知，在哺乳階段，與對(duì)照組相比，無抗日糧中添加腸桿菌肽使哺乳仔豬斷奶末重提高15.6%（P＜0.05），斷奶增重提高21.9%（P＜0.05），斷奶平均日增重提高22.7%（P＜0.05），哺乳階段仔豬腹瀉率降低74.1%（P＜0.05）。在保育階段，與對(duì)照組相比，無抗日糧中添加腸桿菌肽使保育仔豬末重提高27.5%（P＜0.05），保育增重提高33.0%（P＜0.05），平均日增重提高33.3%（P＜0.05），保育仔豬平均日采食量提高19.3%（P＜0.05），保育仔豬耗料增重比降低10.4%（P＜0.05），保育階段仔豬腹瀉率降低66.0%（P＜0.05）。

表2 腸桿菌肽對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑 mm

表3 腸桿菌肽對(duì)哺乳階段仔豬和保育階段仔豬生長性能的影響

2.3 腸桿菌肽對(duì)仔豬糞便大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量的影響 如表4可知，與對(duì)照組相比，日糧中添加腸桿菌肽可以顯著降低哺乳仔豬糞便中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量（P＜0.05），顯著降低保育仔豬糞便中大腸桿菌數(shù)量（P＜0.05），減少沙門氏菌數(shù)量（P＞0.05）。

3 討 論

表4 腸桿菌肽對(duì)哺乳仔豬和保育仔豬糞便微生物數(shù)量的影響

3.1 腸桿菌肽的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果 抗菌肽具有廣譜的抗細(xì)菌、真菌、病毒等功效[6]，腸桿菌肽是一種針對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌譜較窄的抗菌肽，對(duì)革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌和沙門氏菌）有極其良好的殺傷作用。Lope等[7]研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌肽對(duì)沙門氏菌的MIC為3.12 μg/mL。Sable等[8]研究表明，腸桿菌肽對(duì)多種大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離野毒株均有抑制殺滅作用，對(duì)大腸桿菌O157:H7的 MIC 為 1 μg/mL。Portrait等[9]研究表明，腸桿菌肽對(duì)多種沙門氏菌菌株具有抑制殺滅作用。這些研究均表明腸桿菌肽對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌具有很強(qiáng)的抑菌效果。Rintoul等[10]研究表明，腸桿菌肽是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性和抑制RNA轉(zhuǎn)錄2種機(jī)理來抑制大腸桿菌和沙門氏菌。本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果一致，即腸桿菌肽可以在體外抑制大腸桿菌和沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和野毒株的增殖。

3.2 腸桿菌肽對(duì)仔豬生長性能的影響 本試驗(yàn)表明，無抗日糧中添加300 mg/kg腸桿菌肽顯著提高了哺乳仔豬和保育仔豬的平均日增重，降低保育仔豬的耗料增重比，這說明腸桿菌肽有利于仔豬對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)更好地消化吸收。已有研究表明，抗菌肽可以通過殺滅腸道致病菌、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡、改善腸道絨毛形態(tài)來增強(qiáng)腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而提高生長性能[9]。日糧中添加抗菌肽可以提高仔豬[11-13]和肉雞[14]的生長性能。張江等[15]研究表明，腸桿菌肽可以提高斷奶仔豬的平均日增重和飼料利用效率。孫何軍等[16]研究表明，腸桿菌肽可以提高蛋雞的生產(chǎn)性能。

在哺乳和保育階段的仔豬極易受革蘭氏陰性菌感染引起腹瀉，如大腸桿菌和沙門氏菌。研究表明，日糧中添加抗菌肽可以降低仔豬[12,17]和肉雞[18]的腹瀉率。本研究體外試驗(yàn)結(jié)果表明，腸桿菌肽可以抑制殺滅大腸桿菌ATCC25922、AZ1、W1和W2，沙門氏菌sk226和1791，可以顯著降低哺乳階段仔豬和保育階段仔豬的腹瀉率。

3.3 腸桿菌肽對(duì)仔豬糞便大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量的影響 動(dòng)物腸道內(nèi)的微生物區(qū)系平衡對(duì)于維持腸道的功能具有重要作用[19]。日糧中添加抗菌肽可以增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)病原性微生物的抵抗能力[20]。已有研究表明，抗菌肽可以抑制腸道有害微生物（如大腸桿菌）的數(shù)量并提高仔豬健康水平[21-23]。Choi等[18]研究表明，日糧中添加抗菌肽可以降低蛋雞腸道中大腸桿菌數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果亦表明，腸桿菌肽可以降低哺乳仔豬和保育仔豬糞便中的大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量。結(jié)合腸桿菌肽在體外能抑制殺滅大腸桿菌和沙門氏菌的試驗(yàn)結(jié)果，腸桿菌肽可能是通過抑制殺滅腸道中致病性的大腸桿菌和沙門氏菌，進(jìn)而降低哺乳仔豬和保育仔豬腹瀉率，從而提高仔豬的生長性能。

4 結(jié) 論

抗菌肽腸桿菌肽可以抑制大腸桿菌ATCC25922、AZ1、W1、W2及沙門氏菌sk226、1791增殖；無抗日糧中添加腸桿菌肽能減少仔豬腸道大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量，減少仔豬腹瀉，從而提高生長性能。