郭春燕，王雅晶，紀(jì)守坤，嚴(yán) 慧，聶存喜，張文舉*，李勝利*

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市生鮮乳質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，北京 100193；3.晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，山西榆次 030600）

益生菌主要是在數(shù)量或種類上補(bǔ)充腸道內(nèi)減少或缺乏的正常微生物，恢復(fù)腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡。研究表明，添加益生菌活菌制劑可以改善瘤胃內(nèi)環(huán)境[1-3]以及改變瘤胃和后消化道纖維分解菌數(shù)量[4-5]，可提高奶牛產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)及飼料轉(zhuǎn)化率，降低體細(xì)胞數(shù)等[6-8]。

維持瘤胃及腸道內(nèi)的活菌數(shù)量是發(fā)揮消化道菌群功能的基礎(chǔ)和保障。流式細(xì)胞術(shù)（Flow-Cytometer，F(xiàn)CM）能如實(shí)區(qū)分死、活細(xì)菌，從而計(jì)算出它們的比例關(guān)系[13]。隨著FCM的不斷完善，其廣泛應(yīng)用于細(xì)菌存活率檢測(cè)[9-12]。本試驗(yàn)旨在探討添加外源乳酸菌對(duì)奶牛瘤胃和腸道的活細(xì)菌比例及揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的影響，為系統(tǒng)深入地研究益生菌的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 單菌植物乳桿菌為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏日系菌株JCM-1149，分離自泡菜；復(fù)合菌由該實(shí)驗(yàn)室從柳枝稷青貯料中篩選的乳酸菌復(fù)合系SGL，主要由乳桿菌屬、乳球菌屬和芽孢桿菌屬等組成，其中南特港乳桿菌屬（Lactobacillus nantensis）78.78%、植物乳桿菌屬（Lactobacillus plantarum）7.92%、美洲虎乳桿菌屬（Lactobacillus pantheris）5.27%、凝結(jié)芽孢桿菌屬（Bacillus coagulans）4.41%和乳酸乳球菌屬（Lactococcus lactis）3.31%以及其他屬0.31%。將單菌和復(fù)合菌分別加工成菌粉，經(jīng)平板計(jì)數(shù)后，其有效活菌數(shù)分別為8.00×109CFU/g和8.34×109CFU/g。試驗(yàn)開始時(shí)，對(duì)批次生產(chǎn)的乳酸菌菌粉進(jìn)行活菌檢測(cè)，其中植物乳桿菌活菌比例占到89.84%，乳酸菌復(fù)合系的活菌比例高達(dá)94.78%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧 在北京市順義區(qū)中地種畜良種奶?？萍紙@選取4頭體況良好、體重相近的3胎荷斯坦干奶牛，安裝永久性瘤胃瘺管和十二指腸瘺管。待術(shù)后護(hù)理1個(gè)月后，動(dòng)物機(jī)體恢復(fù)至正常狀態(tài)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)飼糧及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 4頭瘺管牛每天09:00和21:00飼喂全混合日糧（TMR），自由采食和飲水。

試驗(yàn)分3期，每期正試期7 d，間隔期20 d。采用自身對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，第1期為空白對(duì)照組，第2、3期（試驗(yàn)組）分別在晨飼后1 h（10:00）打開瘤胃瘺管塞投喂植物乳桿菌和乳酸菌復(fù)合系菌粉。試驗(yàn)組連續(xù)投喂7 d，每天投菌量為80 g/頭，每頭牛每天飼喂活菌量分別為6.40×1011CFU/g和6.67×1011CFU/g。每期試驗(yàn)最后3 d連續(xù)采樣，每天08:00第1次采樣，每次間隔3 h，進(jìn)行24 h動(dòng)態(tài)采集瘤胃液、十二指腸內(nèi)容物及直腸糞樣。

1.4 樣品采集 分別從安裝的瘺管中采集瘤胃液和十二指腸內(nèi)容物各50 mL，糞便由直腸直接取樣約5 g。采集的瘤胃液用4層紗布過濾后，分裝到無菌凍存管中；十二指腸和直腸樣品直接分裝于凍存管中。3個(gè)部位的樣品分別分為2份：1份樣品采集后立即送入實(shí)驗(yàn)室，按試劑盒操作說明書處理后，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定樣品中活菌比例；另1份新鮮樣品分裝到離心管中，其中糞便樣品先溶解于水中再裝入離心管中，經(jīng)3 500 r/min離心10 min，取上清液于-20℃凍存，用于檢測(cè)VFA。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 活 菌 Live/Dead?BacLight?Bacterial Viability Kit（L13152）試劑盒（英濰基（上海）貿(mào)易有限公司）由2種專染核酸染料SYTO-9和PI（碘化丙錠）組成，SYTO-9是一種能滲入完整的細(xì)胞膜的小分子，發(fā)綠色熒光；PI是僅能滲到細(xì)胞膜破損的菌體內(nèi)的大分子，并可與SYTO-9競(jìng)爭(zhēng)核酸著染位點(diǎn)，發(fā)紅色熒光。經(jīng)此試劑盒染色后，發(fā)綠色熒光的為活細(xì)胞，發(fā)紅色熒光的為死細(xì)胞。據(jù)此，BD LSRFortessa多維高清流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD公司）能在極短時(shí)間內(nèi)迅速將死活細(xì)胞分辨出來，如圖1（7號(hào)樣品）。試驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行?；罹壤秊槊糠昼娏魇郊?xì)胞儀收集到的活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例：

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活細(xì)菌和死細(xì)菌

1.5.2 VFA 應(yīng)用氣相色譜儀（TP-2060，北京北分天普儀器技術(shù)有限公司）參照《反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究方法》[14]測(cè)定VFA濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)輸入Excel進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用LSD法對(duì)組間差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 投喂外源乳酸菌對(duì)奶牛瘤胃和十二指腸中活菌比例的影響 如表2所示，在瘤胃中，對(duì)照組全天活菌比例呈先升高后降低的變化規(guī)律，于晨飼后11 h（20:00）出現(xiàn)峰值；而試驗(yàn)組均無周期性變化規(guī)律；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組在08:00、11:00、05:00時(shí)和全天平均活菌比例升高（P＜0.05），而在20:00時(shí)，植物乳桿菌組活菌比例有降低趨勢(shì)，乳酸菌復(fù)合系組活菌比例則顯著降低（P＜0.05）。在十二指腸中，對(duì)照組全天活菌比例無明顯周期性變化，也在20:00時(shí)出現(xiàn)峰值；試驗(yàn)組全天活菌比例無明顯變化規(guī)律；與對(duì)照組相比，乳酸菌復(fù)合系組活菌比例在17:00升高（P＜0.05），而植物乳桿菌組活菌比例在20:00時(shí)顯著降低（P＜0.05），植物乳桿菌組出現(xiàn)峰值的時(shí)間推后到02:00時(shí)。

表2 投喂外源乳酸菌對(duì)奶牛瘤胃與十二指腸中活菌比例的影響 %

2.2 投喂外源乳酸菌對(duì)奶牛胃腸道VFA濃度的影響 因瘤胃及腸道中異丁酸、戊酸以及異戊酸的含量很低，故本試驗(yàn)中總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）含量只計(jì)算乙酸、丙酸和丁酸含量。奶牛胃腸道VFA濃度變化如表3所示，在瘤胃中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組乙酸、丁酸和TVFA濃度降低（P＜0.05），植物乳桿菌組丙酸濃度也顯著降低（P＜0.05），乳酸菌復(fù)合系組丙酸濃度無顯著變化（P＞0.05）；在十二指腸中，與對(duì)照組相比，僅乳酸菌復(fù)合系組的乙酸和TVFA濃度升高（P＜0.05），丙酸和丁酸在各組間差異不顯著（P＞0.05）；直腸中，各組VFA和TVFA濃度差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 投喂外源乳酸菌對(duì)奶牛胃腸道VFA濃度的影響

由圖2可知，在瘤胃中，各組TVFA變化規(guī)律基本一致，均在晨飼（09:00）后2～5 h逐漸升高，之后逐漸下降，采食后11 h（20:00）達(dá)最低值，與對(duì)照組活菌比例出現(xiàn)峰值的時(shí)間一致；在第2次采食（21:00）后也呈相似的周期性變化規(guī)律。在十二指腸中，對(duì)照組TVFA濃度在20:00達(dá)到最低值；乳酸菌復(fù)合系組TVFA濃度高于對(duì)照組，但未表現(xiàn)出明顯的周期性變化規(guī)律；植物乳桿菌組既沒有提高TVFA濃度，也未表現(xiàn)出周期性變化。在直腸中，對(duì)照組全天TVFA濃度也呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在17:00出現(xiàn)峰值；植物乳桿菌組在14:00出現(xiàn)峰值，乳酸菌復(fù)合系組變化比較平緩。

圖2 奶牛胃腸道TVFA晝夜變化規(guī)律

3 討 論

3.1 投喂外源乳酸菌對(duì)奶牛瘤胃和腸道活菌比例的影響本試驗(yàn)中，添加植物乳桿菌和乳酸菌復(fù)合系均可顯著提高瘤胃中活菌比例，但未顯著提高十二指腸中活菌比例，這與Xu等[15]和符運(yùn)勤[16]報(bào)道一致，即飼糧中添加外源益生菌活菌制劑可以提高瘤胃細(xì)菌的數(shù)量，但未改變糞便菌群豐度和多樣性。本試驗(yàn)投喂的外源乳酸菌也增加了瘤胃中活菌的比例，但對(duì)腸道細(xì)菌影響不明顯?？赡芡庠慈樗峋旧砘罹壤^高，通過優(yōu)化瘤胃內(nèi)主導(dǎo)菌群的活性，對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境起到積極作用[17]。而乳酸菌在到達(dá)十二指腸時(shí)，需要通過真胃，其分泌的胃酸、溶菌酶等能夠裂解和殺滅細(xì)菌，致使到達(dá)腸道的活菌比例不足。大量體外試驗(yàn)證明[18-21]，益生菌在發(fā)揮益生作用時(shí)，需要突破胃酸和膽堿的屏障才能有足夠數(shù)量的活菌到達(dá)腸道。由此可見，篩選開發(fā)出具有較高耐受性，且與動(dòng)物品種及生長(zhǎng)階段高度匹配的優(yōu)良菌株及其制劑，才能發(fā)揮益生菌應(yīng)有的功效。

3.2 投喂外源乳酸菌對(duì)瘤胃和腸道VFA濃度的影響 本試驗(yàn)中，添加植物乳桿菌和乳酸菌復(fù)合系均顯著降低了瘤胃中VFA濃度，可能是瘤胃中產(chǎn)生的VFA被添加的乳酸菌利用而產(chǎn)生乳酸[22]，而乳酸則進(jìn)一步被其他細(xì)菌利用，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

在十二指腸中，僅乳酸菌復(fù)合系組提高了乙酸和TVFA濃度，這與Giang等[23]報(bào)道一致，在生長(zhǎng)豬飼糧中添加益生菌可以增加腸道乳酸、乙酸含量，對(duì)丙酸和丁酸沒有影響。其原因可能與添加的乳酸菌種類有關(guān)，一般同型乳酸菌發(fā)酵后只產(chǎn)生乳酸，異型乳酸菌發(fā)酵后除產(chǎn)生乳酸外，還能產(chǎn)生微量乙酸、乙醇及其他短鏈脂肪酸。本試驗(yàn)中，植物乳桿菌屬于同型乳酸菌，發(fā)酵后不會(huì)提升乙酸等其他有機(jī)酸濃度；而乳酸菌復(fù)合系成分較多，發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物較多。在直腸中，添加2種外源乳酸菌對(duì)VFA濃度無顯著影響，這與于卓騰等[24]研究結(jié)果一致，將雞腸道分離出的乳酸菌研制成復(fù)合乳酸菌，從飲水中飼喂給肉仔雞，肉仔雞盲腸中VFA濃度升高，但在飼養(yǎng)后期各組VFA濃度無顯著差異。這可能緣于動(dòng)物不同生長(zhǎng)階段對(duì)乳酸菌的利用有差異。

由上說明，投喂外源植物乳桿菌和乳酸菌復(fù)合系對(duì)瘤胃、十二指腸和直腸VFA濃度的影響依次減弱。其原因可能是細(xì)菌在不同部位發(fā)揮的作用不同，瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌群為一些纖維素降解菌，在腸道中則轉(zhuǎn)化為可利用糖類的微生物[25]。

3.3 投喂外源乳酸菌的不同效果研究 在瘤胃中，乳酸菌復(fù)合系組的乙酸、丙酸和TVFA濃度顯著高于植物乳桿菌組；在十二指腸中，乳酸菌復(fù)合系組的活菌比例顯著高于植物乳桿菌組，且添加乳酸菌復(fù)合系可以顯著提高十二指腸中乙酸和TVFA濃度，說明投喂外源乳酸菌復(fù)合系優(yōu)于單菌植物乳桿菌。這與董曉麗[26]的研究結(jié)果一致，即飼喂植物乳桿菌對(duì)哺乳期犢牛瘤胃中乙酸和TVFA濃度有降低趨勢(shì)，添加植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌的復(fù)合益生菌后TVFA濃度有升高趨勢(shì)。原因可能是本試驗(yàn)乳酸菌復(fù)合系制劑中含有芽孢桿菌，而芽孢桿菌對(duì)抗胃腸道環(huán)境的耐受性強(qiáng)于單純的乳酸菌制劑[27-28]。Rolfe等[29]認(rèn)為，復(fù)合菌效果優(yōu)于單一菌，因?yàn)榍罢吣芨玫卮龠M(jìn)乳酸菌增殖，進(jìn)而發(fā)揮益生功能，且益生菌之間存在組合效應(yīng)[16,30]。

3.4 胃腸道活菌及VFA呈一定的變化規(guī)律 反芻動(dòng)物瘤胃細(xì)菌呈一定的晝夜變化規(guī)律[31-32]。本試驗(yàn)中，對(duì)照組瘤胃活菌比例全天呈先升高后下降的周期性變化，于晨飼后11 h（20:00）出現(xiàn)峰值，這種波動(dòng)反映了營(yíng)養(yǎng)供給以及生理環(huán)境的變化。動(dòng)物剛采食后，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量供給引起細(xì)菌生長(zhǎng)速度加快，到20:00時(shí)達(dá)到最高值，之后隨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和瘤胃細(xì)菌的不斷發(fā)酵，瘤胃內(nèi)pH、滲透壓、溫度等指標(biāo)改變，最終引起細(xì)菌濃度下降。瘤胃中VFA濃度也呈一定的周期性變化[33]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，瘤胃中各組VFA和TVFA濃度的變化規(guī)律一致，均在飼喂后2～5 h逐漸升高，之后逐漸下降，在采食后11 h（20:00）達(dá)最低值。這是因?yàn)閯?dòng)物采食后，飼料被相應(yīng)微生物降解發(fā)酵，產(chǎn)生大量VFA；之后VFA被分解供能，其濃度逐漸降低，瘤胃中VFA保持著邊產(chǎn)生、邊吸收、邊流通的動(dòng)態(tài)平衡。在十二指腸中，對(duì)照組和乳酸菌復(fù)合系組全天活菌比例無明顯周期性變化，但均在20:00出現(xiàn)峰值；對(duì)照組TVFA 濃度變化與瘤胃TVFA濃度變化規(guī)律一致，同樣在20:00到達(dá)最低值。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，投喂外源植物乳桿菌和乳酸菌復(fù)合系均可顯著提高奶牛瘤胃中活菌比例，顯著降低瘤胃中VFA和TVFA濃度，對(duì)腸道消化道微生物活菌比例及VFA濃度影響有限；乳酸菌復(fù)合系的效果優(yōu)于植物乳桿菌；奶牛日飼喂2次，在采食后11 h可能是一個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，在該時(shí)間點(diǎn)瘤胃和十二指腸的活菌比例最高，而VFA濃度最低，說明此時(shí)瘤胃酸性環(huán)境減弱，有利于細(xì)菌存活，為生產(chǎn)中合理補(bǔ)充益生菌制劑的時(shí)間提供依據(jù)。