劉玉華，魏 蔚，崔淑萍

1.平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 平頂山 467000；

2.河南省腫瘤醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450008

胃癌是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因［1］，是東亞、東歐及中南美洲部分地區(qū)最常見的胃腸道惡性腫瘤［2］。盡管診斷手術(shù)技術(shù)和新型分子靶向藥物有了較快的發(fā)展，但胃癌患者的5年總生存率仍較低［3-4］。長鏈非編碼RNA（long-chain noncoding RNA，lncRNA）抗分化非編碼RNA（antidifferentiation noncoding RNA，ANCR）是調(diào)節(jié)性RNA成員之一，長度大于200個(gè)核苷酸，并且不具有蛋白質(zhì)編碼能力［5-6］。有研究表明，lncRNA ANCR參與廣泛的生物學(xué)過程，其失調(diào)涉及多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展［7-8］。本研究通過對(duì)胃癌組織和細(xì)胞株的研究，探討其對(duì)胃癌進(jìn)展和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和臨床標(biāo)本

人胃癌細(xì)胞系BGC-823、MGC-803、AGS、SGC-7901和正常胃上皮細(xì)胞GES-1購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，胃癌細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，正常胃上皮細(xì)胞在1∶1混合精制的KSFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。河南省腫瘤醫(yī)院2016年1月1日—2016年12月1日獲得60例臨床胃癌樣本和20例對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本（距癌組織2 cm）。患者年齡38～74歲，中位年齡59歲。si-ANCR和si-NC（陰性對(duì)照）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司?；颊邊⑴c前均簽署知情同意書，標(biāo)本收集符合倫理委員會(huì)的要求（倫理編號(hào)：SYXK（豫）2015－0009）。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）分析

上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)ANCR引物的正義鏈：ACAGGACTCCATGGCAA ACG，反義鏈：ATGAAGAAAGCCTGGTGC AGT；GAPDH的正義鏈：ACCACAGTCC ATGCCATCAC，反義鏈：TCCACCACCCT GTTGCTGTA。使用TRIzol試劑從組織或細(xì)胞中分離總RNA，并按照制造商的說明書用反轉(zhuǎn)錄酶［購自寶生物工程（大連）有限公司］和寡核苷酸（dT）合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒進(jìn)行RTFQ-PCR。RTFQ-PCR的條件如下：94 ℃ 10 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 30 s退火，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)

將胃癌細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板上并再培養(yǎng)2周，中間每隔1周更換新鮮培養(yǎng)液，2周后使用考馬斯亮藍(lán)染色細(xì)胞形成菌落，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，對(duì)比兩組之間的差距。

1.4 Transwell侵襲試驗(yàn)

將胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，將無血清培養(yǎng)基中的1×105個(gè)細(xì)胞接種在Transwell遷移室中。Transwell的上室用基質(zhì)膠涂覆。含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基加入到下室中。24 h后，用棉絨除去未侵入的細(xì)胞。位于小室下表面的侵襲性細(xì)胞用結(jié)晶紫染色液染色，然后用顯微鏡計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)。

1.5 熒光素酶報(bào)告基因測定

從正常人基因組DNA擴(kuò)增含有l(wèi)ncRNA ANCR互補(bǔ)位點(diǎn)的miR-331，并克隆到熒光素酶報(bào)告基因載體psi-CHECK載體中，將該結(jié)合位點(diǎn)作為miR-331野生型。使用miR-331突變體重組質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒組合后48 h，根據(jù)制造商的說明使用雙熒光素酶測定試劑盒檢測熒光素酶活性，共轉(zhuǎn)染的海腎熒光素酶質(zhì)粒用作確定轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)部對(duì)照，使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。miR-331克隆的引物如下：5'-GCTCTAG AGCTTCGGCTGGGACCTT-3'；3'-ATAAG AATGCGGCCGCGGGCCTCTTCTG-5'。

1.6 裸鼠腫瘤異種移植模型

從河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院購買12只雌性裸鼠，在SPF級(jí)屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)［SYXK（豫）2017—0001］。將1×106濃度的si-NC組和ANCR-si組MGC-803細(xì)胞分別注射到12只4周齡裸鼠的腋窩中。飼養(yǎng)5周后檢測裸鼠腫瘤異種移植物的體積和質(zhì)量生長情況。異體移植物大小根據(jù)以下公式測量：體積=1/2（最短直徑）2×（最長直徑）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0對(duì)記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，采用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行分析；所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LncRNA ANCR在胃癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)

RTFQ-PCR結(jié)果見表1，lncRNA ANCR在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.36，P=0.045）；LncRNA ANCR在腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)顯著高于正常胃上皮細(xì)胞GES-1（t=12.96，P=0.024），而且lncRNA ANCR在BGC-823和MGC-803細(xì)胞中的表達(dá)高于其他細(xì)胞株（t=14.51，P=0.019）。所以本研究選擇lncRNA ANCR表達(dá)較高的BGC-823和MGC-803細(xì)胞做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

表 1 LncRNA ANCR在不同組織與細(xì)胞株中的表達(dá)情況Tab. 1 Expression of lncRNA ANCR in different tissues and cell lines

2.2 LncRNA ANCR的表達(dá)與胃癌患者臨床病理資料的相關(guān)性

本研究分析了60例胃癌患者的臨床病理資料及其lncRNA ANCR的表達(dá)，結(jié)果見表2，ANCR的表達(dá)水平以所收集數(shù)據(jù)總體水平的70%為對(duì)應(yīng)分界線，分為高表達(dá)和低表達(dá)。在腫瘤體積、臨床病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否上，患者的lncRNA ANCR表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.3 LncRNA ANCR對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC-803和BGC-823增殖能力的影響

本實(shí)驗(yàn)通過平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測lncRNA ANCR對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803與BGC-823增殖能力的影響。在MGC-803細(xì)胞中，si-ANCR組的細(xì)胞克隆數(shù)（98.8±10.4）顯著少于si-NC組（175.9±5.7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.16，P=0.013，圖1A）。類似的結(jié)果在BGC-823細(xì)胞中也得到證實(shí)，si-ANCR組的細(xì)胞克隆數(shù)（67.3±9.2）顯著也少于si-NC組（142.1±6.6），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.93，P=0.026，圖1B）。這提示lncRNA能促進(jìn)胃癌細(xì)胞株MGC-803和BGC-823的增殖。

2.4 LncRNA ANCR對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC-803和BGC-823侵襲能力的影響

Transwell侵襲結(jié)果顯示，在MGC-803細(xì)胞中，si-NC組通過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為（231.5±23.2），明顯多于si-ANCR組（165.4±81.1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.64，P=0.028，圖2A），提示抑制lncRNA ANCR的表達(dá)可以減弱胃癌MGC-803細(xì)胞的侵襲能力；在BGC-823細(xì)胞中，si-NC組（223.4±13.4）的細(xì)胞侵襲能力也顯著高于s i-A N C R組（115.6±10.7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.28，P=0.014，圖2B），提示lncRNA ANCR能提升胃癌細(xì)胞株MGC-803和BGC-823的侵襲能力。

表 2 LncRNA ANCR的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab. 2 Relationship between LncRNA ANCR expression and clinicopathological features of gastric cancer patients

圖1 LncRNA ANCR對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC-803與BGC-823增殖能力的影響Fig. 1 Effect of lncRNA ANCR on the proliferation of gastric cancer cell lines MGC-803 and BGC-823

2.5 LncRNA ANCR對(duì)裸鼠成瘤的影響

通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測LncRNA ANCR對(duì)裸鼠成瘤的影響（圖3A）。5周后裸鼠內(nèi)移植瘤的重量與NC組［（1.52 ±0.14）g］相比，s i-A N C R組的裸鼠體內(nèi)腫瘤的質(zhì)量［（0.61±0.11）g］縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.32，P=0.043，圖3B）；si-ANCR組的腫瘤體積的增長［（1.58±0.21）cm3］也隨著時(shí)間的推進(jìn)小于si-NC組［（0.63±0.09）cm3］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.31，P=0.016，圖3C）。結(jié)果表明，抑制ANCR的表達(dá)后在裸鼠體內(nèi)腫瘤抑制模型得到同樣的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，抑制ANCR后可以有效減少胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖。

圖 2 LncRNA ANCR對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC-803與BGC-823侵襲能力的影響Fig. 2 Effect of lncRNA ANCR on the invasion of gastric cancer cell lines MGC-803 and BGC-823

圖 3 LncRNA ANCR 對(duì)裸鼠成瘤的影響Fig. 3 Effect of lncRNA ANCR on tumor formation in nude mice

2.6 LncRNA ANCR與miR-331的直接作用關(guān)系

本研究通過Targetscan網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)ANCR與miR-331具有一定的結(jié)合位點(diǎn)，兩者可能有內(nèi)在調(diào)控關(guān)聯(lián)（圖4A）。為了驗(yàn)證ANCR能否與miR-331結(jié)合，我們將ANCR與miR-331共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，通過雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，ANCR可以抑制野生型miR-331的熒光素酶活性（t=13.25，P=0.024），而對(duì)突變型miR-331的熒光素酶活性影響不大（t=11.58，P=0.095，圖4B）；抑制ANCR的表達(dá)后可以一定程度上調(diào)miR-331的表達(dá)水平（圖4C），表明ANCR的確可以與miR-331特異性結(jié)合，從而證實(shí)ANCR與miR-331之間的相互作用關(guān)系。

圖 4 LncRNA ANCR與miR-331的直接作用關(guān)系Fig. 4 Direct interaction between lncRNA ANCR and miR-331

3 討 論

LncRNA ANCR是由855個(gè)核苷酸組成的lncRNA［9］。它是在USP46基因上游的人染色體4上發(fā)現(xiàn)的lncRNAs的成員，并且在其第一和第二內(nèi)含子中嵌入mIR4449和SNORNA26［10］。ANCR可以通過不同的模式進(jìn)行調(diào)控，包括信號(hào)通道、分子誘餌及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的支架［11］，增強(qiáng)RNA以調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移［12］。有研究已經(jīng)證明，ANCR與EZH2相互作用并促進(jìn)CDK1-EZH2結(jié)合，以增加其在Thr-345處的磷酸化Thr-487殘基，導(dǎo)致EZH2泛素化和降解乳腺癌細(xì)胞［13］。這項(xiàng)研究旨在闡明lncRNA ANCR在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的生理和病理過程。還有研究顯示，lncRNA ANCR的下調(diào)能抑制結(jié)直腸癌的侵襲和遷移，而且也是通過調(diào)節(jié)EZH2的表達(dá)而造成的［14］。在本研究中，首先證實(shí)了lncRNA ANCR在胃癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)的狀態(tài)，而且與胃癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)密切相關(guān)，推測其可能是一個(gè)促癌分子。此外，lncRNA ANCR的低表達(dá)減弱了胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，減緩了胃癌細(xì)胞在體內(nèi)和體外的生長轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明，lncRNA ANCR可能是胃癌發(fā)病過程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)分子，具有成為一個(gè)新的預(yù)后指標(biāo)或靶向治療因子的潛力。

miRNA是18～23個(gè)核苷酸的小RNA，通過結(jié)合mRNA的3'非翻譯區(qū)進(jìn)行調(diào)控［15］。越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)涉及到人類腫瘤的發(fā)展［16］。miR-331位于染色體的12q22n，在前列腺癌中已被證明是一種腫瘤抑制miRNA［17］。除此之外，miR-331的異常表達(dá)在淋巴細(xì)胞白血病中也被證實(shí)，它參與細(xì)胞的增殖和遷移［18］。然而，miR-331在胃癌的腫瘤發(fā)生中的作用仍然未知。因此本研究進(jìn)一步對(duì)lncRNA ANCR與miR-331的相互作用機(jī)制進(jìn)行探究，檢測lncRNA ANCR的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織及胃癌細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步抑制lncRNA ANCR的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖、侵襲受到明顯抑制，這也驗(yàn)證lncRNA ANCR在胃癌的進(jìn)展過程中起著促癌基因的作用，同時(shí)使用TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA ANCR的靶基因，發(fā)現(xiàn)lncRNA ANCR與miR-331具有互補(bǔ)結(jié)合序列，推測miR-331為lncRNA ANCR的下游靶基因。lncRNA在人類疾病中的重要性可能與其多向調(diào)節(jié)不同細(xì)胞功能的能力有關(guān)［19］。最近，一個(gè)新的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)被證明，在lncRNA和mRNA之間通過競爭共同的miRNA反應(yīng)元件而相互影響［20］。在這種情況下，lncRNA可能作為競爭性內(nèi)源性RNA發(fā)揮功能，通過吸附miRNA，從而調(diào)控miRNA靶標(biāo)，并增加額外的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平［21］。采用生物信息學(xué)分析和熒光素酶測定來驗(yàn)證miRNA應(yīng)答元件在全lncRNA ANCR的轉(zhuǎn)錄本上的結(jié)合能力。結(jié)果與預(yù)期一致，我們發(fā)現(xiàn)miR-331可以與lncRNA ANCR形成互補(bǔ)堿基配，證實(shí)了lncRNA ANCR與miR-331之間的相互作用關(guān)系。

綜上所述，lncRNA ANCR能增加胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，能促進(jìn)胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長轉(zhuǎn)移，lncRNA ANCR可能作為內(nèi)源因子調(diào)控miR-331的表達(dá)，為研究胃癌發(fā)生的分子機(jī)制和探索新的潛在治療策略提供相應(yīng)理論幫助，甚至可以提高胃癌的早期診斷和治療效果。