楊 睿，陳俊霞

重慶醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，重慶 400016

乳腺癌是嚴(yán)重威脅全球女性健康的腫瘤，占全部女性惡性腫瘤的23%。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，在發(fā)達(dá)國(guó)家中乳腺癌的病死率有所下降，但是在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率仍在不斷上升，乳腺癌仍是因癌癥導(dǎo)致女性死亡的主要原因［1］。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）均為陰性的一類乳腺癌，占全部乳腺癌的10%～20%。TNBC多發(fā)生于年輕女性（＜40歲），侵襲性強(qiáng)，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，是一種高危乳腺癌，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，迄今缺乏有效的治療手段［2］。因此，迫切需要尋找診斷和治療TNBC的新的生物標(biāo)志物。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)，許多非編碼RNA在腫瘤中存在差異表達(dá)，在功能上起著致癌或抑癌基因的作用［3］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是新近發(fā)現(xiàn)的具有重要調(diào)節(jié)潛能的非編碼RNA，它不具有5'末端帽子和3'末端尾巴，呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)［4］。研究表明，環(huán)狀RNA參與了肺癌、肝癌及結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5］，但目前有關(guān)環(huán)狀RNA在TNBC中的報(bào)道較少。本研究利用RNA測(cè)序（RNA sequencing，RNA-seq）對(duì)4對(duì)TNBC組織及癌旁組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA hsa_circ_0058514在TNBC組織中高表達(dá)，hsa_circ_0058514來(lái)源于AGFG1基因的第2到第5個(gè)外顯子，經(jīng)剪接后形成長(zhǎng)度為527 nt的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本，目前尚未見(jiàn)有關(guān)hsa_circ_0058514的報(bào)道。本研究進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒下調(diào)hsa_circ_0058514的表達(dá)，探討其在TNBC增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞凋亡和周期中的作用，為尋找TNBC診斷和治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和組織標(biāo)本

TNBC細(xì)胞MDA-MB-231、BT-549和正常人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A由重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心保存。本研究中的20例TNBC組織和癌旁組織來(lái)自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，20例患者均為女性，平均年齡（51.40±9.10）歲，其中非特殊型癌16例，髓樣癌3例，化生性癌1例，TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期10例，Ⅲ期1例。所有患者均簽署知情同意書(shū)，所有標(biāo)本經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病理診斷，并在手術(shù)后立即投入液氮中，標(biāo)本的收集均得到重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑

培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；MEBM培養(yǎng)基套裝購(gòu)自瑞士Lonza公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自重慶博全生物科技有限公司；hsa_circ_0058514干擾質(zhì)粒pLL3.7-shcirc和對(duì)照質(zhì)粒pLL3.7-sh-nc由廣州吉賽生物科技股份有限公司合成；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Cell-LightTMEdU Apollo567In VitroKit購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclindependent kinase 2，CDK2）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA測(cè)序

提取4對(duì)TNBC組織及癌旁組織總RNA，Nanodrop檢測(cè)總RNA的純度，利用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)RNA完整度，質(zhì)檢合格后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。RNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序及差異基因分析均由廣州吉賽生物科技股份有限公司提供技術(shù)服務(wù)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

TNBC細(xì)胞MDA-MB-231和BT-549均使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，正常人乳腺上皮細(xì)胞使用MEBM培養(yǎng)基，3株細(xì)胞均在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。將TNBC細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，使用LipofectamineTM2000按照說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，48 h后收獲細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fuorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

用TRIzol法提取TNBC組織和癌旁組織以及正常人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和TNBC細(xì)胞MDA-MB-231和BT-549總RNA，瓊脂糖凝膠電泳判斷提取RNA的完整性，酶標(biāo)儀檢測(cè)其濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用美國(guó)Bio-Rad公司的RTFQ-PCR儀進(jìn)行RTFQ-PCR。hsa_circ_0058514上游引物序列：5'-CCAG T T G TA G G T C G T T C T C A A G-3'，下游引物序列：5'-G G AT T TA AT C C T C G C CTGCATG-3'；GAPDH上游序列：5'-GAAGGT GAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物序列：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC -3'。以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 5 s變性，60℃ 30 s退火，72 ℃30 s延伸，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，用2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建

以全基因合成法分別合成s h-c i r c（5'GTTAACATGCAGGCGAGGATTAAATTC AAGAGATTTAATCCTCGCCTGCATTT TTTTCTCGAG3'）和sh-nc（5'-TTCTCCGAACG TGTCACGTTCAAGAGACGTGACACG TTCGGAGAATTTTTT-3'），分別在5'端加入HpaI酶切位點(diǎn)，3'端加入XhoI酶切位點(diǎn)，目的片段雙酶切后連接入pLL3.7載體中。載體構(gòu)建完成后經(jīng)測(cè)序鑒定。

1.2.5 CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將各組細(xì)胞制成密度為1×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種到96孔板中，在溫箱內(nèi)37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24、48、72和96 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液并混勻，再將細(xì)胞放入溫箱溫育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（D）值，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)Cell-LightTMEdU Apollo567In VitroKit試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、Apollo染色及DNA染色，最后在熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，待各組細(xì)胞融合度達(dá)到95%左右時(shí)，用200 μL的槍頭進(jìn)行劃痕，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后于倒置顯微鏡下觀察，0 h劃痕距離與24 h劃痕距離的差值即為細(xì)胞的相對(duì)遷移能力。

1.2.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

將BD基質(zhì)膠與不含血清的DMEM培養(yǎng)基按1∶8進(jìn)行稀釋，取50 μL基質(zhì)膠稀釋液包被Transwell小室的上室面，4 ℃風(fēng)干過(guò)夜。用不含血清的DMEM培養(yǎng)基將轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞制成密度為2.5×105/mL的細(xì)胞懸液，每孔200 μL接種到Transwell小室的上室中，下室加入500 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕輕擦去基質(zhì)膠和上室中的細(xì)胞，甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，光鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，用PBS洗3次，以1 000 r/min離心5 min后棄上清，用Annexin結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μL的Annexin V-PE室溫避光溫育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，PBS洗3次，用70%的乙醇于4 ℃固定過(guò)夜。以1 000 r/min離心5 min后吸除乙醇，加入PBS洗滌，再加入0.5 mL的聚酰亞胺溶液（50 μg/mL）室溫避光溫育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.2.10 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液后提取各組細(xì)胞總蛋白，然后每孔按30 μg進(jìn)行上樣，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠恒壓80 V電泳分離后恒流250 mA轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉常溫慢搖封閉2 h，4 ℃下溫育一抗（兔抗GAPDH 1∶5 000，CCNE1 1∶1 000，CDK2 1∶1 000）過(guò)夜，37 ℃下溫育羊抗兔二抗（1∶5 000）2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Bio-Rad凝膠成像儀內(nèi)拍照，并用Quantity One對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hsa_circ_0058514在TNBC組織和TNBC細(xì)胞中高表達(dá)

應(yīng)用RNA-seq對(duì)4對(duì)TNBC組織和癌旁組織進(jìn)行測(cè)序并做差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)47個(gè)環(huán)狀RNA的表達(dá)上調(diào)，307個(gè)環(huán)狀RNA表達(dá)下調(diào)。其中hsa_circ_0058514在TNBC中上調(diào)倍數(shù)最高，上調(diào)倍數(shù)為15.04倍（圖1）。RTFQ-PCR檢測(cè)20對(duì)TNBC組織和癌旁組織以及正常人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和TNBC細(xì)胞MDA-MB-231和BT-549中hsa_circ_0058514的表達(dá)，結(jié)果顯示，hsa_circ_0058514在TNBC組織中的表達(dá)（5.15±2.15）顯著高于癌旁組織（2.26±1.49）（P＜0.0 5，圖2 A），其在T N B C細(xì)胞MDA-MB-231和BT-549中的表達(dá)分別為7.35±0.86和5.04±0.54，均明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A（1.00±0.03）中的表達(dá)（P＜0.001，圖2B）。

2.2 hsa_circ_0058514干擾質(zhì)粒效率驗(yàn)證

pLL3.7-sh-circ和pLL3.7-sh-nc質(zhì)粒構(gòu)建后經(jīng)測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示，測(cè)序峰圖正常，序列吻合，表明sh-circ和sh-nc的序列成功插入pLL3.7載體中（圖3A）。將pLL3.7-sh-circ和pLL3.7-sh-nc轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞后，RTFQ-PCR檢測(cè)細(xì)胞中hsa_circ_0058514的表達(dá)量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pLL3.7-sh-circ的細(xì)胞中hsa_circ_0058514的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.001，圖3B）。

圖 1 TNBC組織和癌旁組織中部分差異表達(dá)的circRNA熱圖Fig. 1 Heat map of differentially expressed circRNAs in TNBC tissues and paracancerous tissues

圖 2 RTFQ-PCR檢測(cè)hsa_circ_0058514在TNBC組織和TNBC細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 2 The relative expression of hsa_circ_0058514 in TNBC tissues (A) and cells (B) was detected by RTFQ-PCR**: P＜0.01; ***: P＜0.001

圖 3 質(zhì)粒鑒定及效率驗(yàn)證Fig. 3 Plasmid identification and efficiency verification

2.3 下調(diào)hsa_circ_0058514對(duì)TNBC細(xì)胞增殖的影響

將pLL3.7-sh-nc和pLL3.7-sh-circ轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞后，采用CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)其增殖能力。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)觀察96 h后，MDA-MB-231干擾組細(xì)胞D450為0.87±0.01，對(duì)照組D450為1.25±0.02，BT-549干擾組細(xì)胞D450為1.22±0.07，對(duì)照組D450為1.65±0.09（圖4A），提示下調(diào)hsa_circ_0058514顯著抑制TNBC細(xì)胞增殖。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MDA-MB-231干擾組細(xì)胞增殖率為37.17±2.52，對(duì)照組細(xì)胞增殖率為52.13±4.21，BT-549干擾組細(xì)胞增殖率為30.05±2.90，對(duì)照組細(xì)胞增殖率為58.88±3.18（圖4B、C），表明下調(diào)hsa_circ_0058514后，TNBC細(xì)胞的增殖能力明顯降低。

圖 4 下調(diào)hsa_circ_0058514對(duì)TNBC細(xì)胞增殖能力的影響Fig. 4 Effects of down regulation of hsa_circ_0058514 on the proliferation of triple-negative breast cancer cells

2.4 下調(diào)hsa_circ_0058514對(duì)TNBC細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

將pLL3.7-sh-nc和pLL3.7-sh-circ轉(zhuǎn)染MDAMB-231和BT-549后，利用劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)其遷移和侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLL3.7-sh-circ后，遷移距離為（2.87±0.35）mm，而對(duì)照組細(xì)胞遷移距離為（1.70±0.26）mm，BT-549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLL3.7-sh-circ后，遷移距離為（2.20±0.40）mm，對(duì)照組細(xì)胞遷移距離為（3.13±0.35）mm（圖5A、B），表明下調(diào)hsa_circ_0058514能夠顯著抑制細(xì)胞遷移能力。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MDA-MB-231干擾組細(xì)胞穿膜數(shù)量為（64.67±12.22）個(gè)/視野，而對(duì)照組細(xì)胞穿膜數(shù)量為（30.67±5.51）個(gè)/視野，BT-549干擾組細(xì)胞穿膜數(shù)量為（44.33±10.07）個(gè)/視野，對(duì)照組細(xì)胞穿膜數(shù)量為（104.00±8.54）個(gè)/視野（圖5C、D），說(shuō)明下調(diào)hsa_circ_0058514能夠顯著抑制細(xì)胞的侵襲能力。

圖 5 下調(diào)hsa_circ_0058514對(duì)TNBC細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響Fig. 5 Effects of downregulation of hsa_circ_0058514 on the migration and invasion of triple-negative breast cancer cells

2.5 下調(diào)hsa_circ_0058514對(duì)TNBC細(xì)胞凋亡的影響

TNBC細(xì)胞MDA-MB-231分別轉(zhuǎn)染pLL3.7-sh-nc和pLL3.7-sh-circ后，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)兩組細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，干擾組細(xì)胞凋亡率為10.35%±1.39%，而對(duì)照組凋亡率為3.60%±0.80%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖6），表明下調(diào)hsa_circ_0058514可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖 6 下調(diào)hsa_circ_0058514對(duì)TNBC細(xì)胞凋亡的影響Fig. 6 Effects of downregulation of hsa_circ_0058514 on apoptosis of triple-negative breast cancer cells

2.6 下調(diào)hsa_circ_0058514對(duì)TNBC細(xì)胞周期的影響

T N B C細(xì)胞M D A-M B-2 3 1分別轉(zhuǎn)染pLL3.7-sh-nc和pLL3.7-sh-circ后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示，干擾組細(xì)胞G1期為73.93%±1.24%，對(duì)照組細(xì)胞G1期為63.97%±3.19%。干擾組細(xì)胞S期為19.61%±1.07%，而對(duì)照組細(xì)胞S期為28.13%±2.77%，表明下調(diào)hsa_circ_0058514將細(xì)胞周期阻滯于G1期（P＜0.05，圖7）。

2.7 下調(diào)hsa_circ_0058514對(duì)CCNE1和CDK2蛋白表達(dá)的影響

將pLL3.7-sh-nc和pLL3.7-sh-circ轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞48h后提取蛋白，用Western blot檢測(cè)CCNE1和CDK2蛋白水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，下調(diào)hsa_circ_0058514后，CCNE1和CDK2蛋白水平均顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.001，圖8）。

圖 7 下調(diào)hsa_circ_0058514對(duì)TNBC細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響Fig. 7 Effects of downregulation of hsa_circ_0058514 on cell cycle of triple-negative breast cancer cells MDA-MB-231

圖 8 下調(diào)hsa_circ_0058514對(duì)TNBC細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響Fig. 8 Effects of downregulation of hsa_circ_0058514 on protein levels of triple-negative breast cancer cells

3 討 論

TNBC作為乳腺癌的一個(gè)獨(dú)特的亞型，具有更高的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率及死亡率。由于不表達(dá)ER、PR和HER2，TNBC患者不能從抗HER2靶向治療和內(nèi)分泌治療中獲益，化療是臨床上常用的治療手段［6］，與其他亞型的乳腺癌相比，雖然TNBC對(duì)化療更加敏感，但是由于耐藥性，化療的應(yīng)用也受到限制。因此，尋找診斷和治療TNBC的新的生物標(biāo)志具有重要意義。

ncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。近年來(lái)隨著生物信息學(xué)和RNA-seq技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，circRNA作為ncRNA家族的新成員出現(xiàn)在研究者的視線中。由于其特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使環(huán)狀RNA具有較高的穩(wěn)定性，研究還發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA廣泛存在于真核生物的細(xì)胞內(nèi)，并且其表達(dá)具有細(xì)胞和組織特異性以及時(shí)空特異性［7-8］，因此，circRNA的研究具有非常重要的意義。有研究報(bào)道，circRNA與多種腫瘤密切相關(guān)，如肝癌、肺腺癌、膀胱癌、胃癌及乳腺癌等［9-13］。Tang等［14］采用芯片技術(shù)得到了乳腺癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的circRNA，用RTFQ-PCR證實(shí)了circRNA hsa_circ_0001982在乳腺癌組織中高表達(dá)，通過(guò)系列功能實(shí)驗(yàn)證明hsa_circ_0001982能夠促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。還有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-000911在乳腺癌中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)circRNA-000911后能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，提示circRNA-000911有望成為乳腺癌診斷和治療的靶點(diǎn)［15］。

在本研究中，我們首先利用RNA高通量測(cè)序分析了4對(duì)TNBC組織及癌旁組織，獲得了circRNA的差異表達(dá)譜，并進(jìn)一步利用RTFQ-PCR技術(shù)證實(shí)了circRNA hsa_circ_0058514在TNBC組織和TNBC細(xì)胞中均呈高表達(dá)。然后我們針對(duì)hsa_circ_0058514成功構(gòu)建了干擾質(zhì)粒，接著通過(guò)一系列的體外實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)hsa_circ_0058514后，能夠顯著降低TNBC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的TNBC細(xì)胞與對(duì)照組相比，干擾組細(xì)胞G1期百分率明顯上升，而S期百分率顯著下降，表明下調(diào)hsa_circ_0058514可使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而降低了細(xì)胞分裂的速度。最后通過(guò)Western blot證明，hsa_circ_0058514可以調(diào)節(jié)CCNE1和CDK2蛋白的表達(dá)。眾所周知，CCNE1通過(guò)與CDK2形成復(fù)合體發(fā)揮作用，CCNE1-CDK2復(fù)合物在G1/S期轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。研究表明，CCNE1的過(guò)度表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，包括肺癌、膀胱癌、皮膚癌及乳腺癌等［16］，并且CCNE1是乳腺癌預(yù)后的一個(gè)標(biāo)志物，其表達(dá)量與腫瘤的分級(jí)和分期呈正相關(guān)［17］。在本研究中，下調(diào)hsa_circ_005814后，CCNE1和CDK2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，表明hsa_circ_0058514可影響CCNE1-CDK2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而調(diào)控TNBC的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，circRNA hsa_circ_0058514下調(diào)后能夠抑制TNBC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，提示hsa_circ_0058514有望成為T(mén)NBC治療的新靶點(diǎn)。